Analyses of berberine-bridge like enzymes in Nicotiana rustica based on structural biology

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K06731
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 森元 聡 九州大学, 薬学研究院, 教授 (60191045)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ベルベリンブリッジ酵素 / マルバタバコ / フェルラ酸 / コニフェリルアルコール / コニフェリルアルデヒド / 酸化酵素

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、nicotine含量の高いマルバタバコからBBL遺伝子のクローニングを試みた結果、BBLa, BBLb, BBLcをクローニングし、これらの遺伝子をカイコ中で発現することに成功た。次いで、本酵素の活性を測定した結果、BBLaはconiferyl alcholを酸化してconiferyl aldehydeやferulic acidに変換することが判明した。Alcohol体からacid体への変換は、通常2種の酵素（alcohol脱水素酵素およびにaldehyde脱水素酵素）が関与することが知られているが、BBLaはこの酵素のみでalcohol体をacid体に変換するという特異な能力を有することが明らかとなった。
また、カイコで発現させたBBLaをferulic acidを基質として反応させた場合、未知化合物の生成が確認された。本化合物を単離し、構造を決定した結果、ferulic acidの脱炭酸体であることが判明した。すなわちBBLaは酸化反応のみならず脱炭酸反応を触媒するという極めて珍しい反応を触媒することが判明した。
さらに申請研究では、BBLaの活性部位の探索も併せて検討した。本酵素はフラビンタンパク質と推定されたので、フラビン結合部に変異を導入したBBLa遺伝子を作成し、これをカイコで発現させた結果、活性が著しく低下することを確認した。したがって本酵素反応にはフラビンが関与することが証明された。
また、申請課題ではBBLa がnicotineの生合成に関与していると推定し、本仮説を証明する検討を行った。しかしながら、カイコで発現したBBLaはdihydrometanicotineをいかなる条件でもnicotineへ変換しないことが判明した。従って、タバコBBL類はnicotineの生合成に関与してないか、別の化合物を基質とする可能性が推察された。