新規ベンゾ(a)ピレンDNA付加体形成メカニズムの解明と遺伝毒性予防食品の探索

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06736
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 宇野 茂之 日本大学, 医学部, 講師 (90307851)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: DNA付加体 / ベンゾ(a)ピレン / 遺伝毒性 / 導波モード

Outline of Annual Research Achievements

煙草煙や加熱食品に含まれる発がん物質であるベンゾ(a)ピレン(BaP)は、DNA付加体形成による遺伝子毒性の主要因である。DNA 付加体形成の主成分である7,8-diol-9,10-epoxy BaP(BPDE)は、BaPがダイオキシン受容体（AHR）を介して誘導するCYP1A1によって形成されると言われてきた。しかしながら、申請者らのCyp1a1遺伝子欠損マウスの結果は、CYP1A1以外の酵素の存在を明らかにしたが、分子の同定には至っていない。そこで本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的とする。目的達成には、変異原性のインディケーター試験にも使用されている32Pポストラベル法によるDNA付加体検出よりも簡便かつ迅速な検出法が有用である。
平成30年度では光センシングシステムを利用した導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法の確立を試みた。導波モードのセンサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体で反応後、HRP標識2次抗体とAEC反応による検出法はBPDE付加体含有DNAサンプルを検出することができたが、シグナル値/ネガティブ値（S/N比）が低かった。そこで現在BPDE抗体にHRPを標識し、サンドイッチ法を用いることでS/N比が改善できるかを検討している。
簡易DNA付加体検出法の確立に時間を要すると判断し、平成31年度より遂行予定であったDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いてBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成への影響を検討し、DNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的としており、目的達成を実現するにあたり、DNA付加体検出をより簡便かつ迅速にする必要があると考え、H30年度において導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法を確立することを研究遂行計画とした。当初の計画では導波モードセンサーの検出系として（１）センサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体と反応後、HRP-AECによる検出（２）BPDE抗体を固定したセンサーチップを用いてヌクレアーゼP1処理し、5’末端標識したBPDE付加体含有DNAサンプルを検出する2つの方法のいずれかで検出が可能であると考えていたが、実際に検討したところ（１）はS/N比の低値、（２）はバックグランド値の高値といった問題が生じることが明らかになった。そこでこれらの問題を解決する為にBPDE抗体にHRPを標識し、サンドイッチ法を用いることで改善できるかを現在検討しており、ELISAでの検討ではこれらの問題を改善できることを確認したが、導波モードでの検討を現在遂行しており、導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法はまだ確立しておらず、当初の計画からやや遅れている。
簡易DNA付加体検出法の確立に時間を要すると判断し、平成31年度より遂行予定であったDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いてBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成への影響を検討し、DNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出し、DNA付加体形成メカニズムの解明は当初の計画より進展している。
これらのことから現在までの進捗状況は、総合的におおむね順調に進展していると評価した。

Strategy for Future Research Activity

（平成31年度）平成31年度では導波モードセンサーを用いた簡易DNA付加体検出法の検出感度の問題点をBPDE抗体のHRP標識を用いたサンドイッチ法により改善し、導波モードセンサーを用いた簡易DNA付加体検出法を早急に確立する。検出感度の改善が困難な場合は、ビオチンアビジン反応を利用したポリマーHRP標識BDPE抗体を作成し検出感度の問題の改善を試みる。
平成30年度の先行研究においてDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明を従来法であるポストラベリング法を用いBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤のDNA付加体形成を抑制する阻害剤を見出した。そこで平成31年度では関与が確認できた阻害剤に対する分子のsiRNAを用い、DNA付加体形成の抑制を再確認し候補分子を決定する。候補分子の阻害剤、siRNAを用いBaP代謝産物およびDNA付加体をHPCLおよびUPLC/MS/MSによって解析し、新たなDNA付加体形成メカニズムを提示する。
（平成32年度）DNA付加体形成に影響を及ぼすファイトケミカルの探索をする。がん予防が期待できる代表的なファイトケミカルであるポリフェノール、カロテノイド、イオウ化合物、テルペン類、β-グルカン、更にこれらに加え、候補分子に対する阻害効果を示す報告があるファイトケミカルをスクリーニングの対象とする。ELISA法による候補分子の酵素活性の阻害効果と、確立した簡易DNA付加体検出法用いDNA付加体形成抑制効果を測定することで、DNA付加体形成を抑制する食品成分を検索する。次にin vivoでのファイトケミカルのDNA付加体形成および発がんへの効果をDNA付加体形成と腺がん発症のモデル動物であるCyp1a1遺伝子欠損マウスを用い検討する。これら研究成果を原著論文として英文専門誌に報告する。