新規ベンゾ(a)ピレンDNA付加体形成メカニズムの解明と遺伝毒性予防食品の探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06736
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 宇野 茂之 日本大学, 医学部, 講師 (90307851)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ベンゾ(a)ピレン / DNA付加体 / 導波モードセンサー

Outline of Annual Research Achievements

煙草煙や加熱食品に含まれるベンゾ(a)ピレン(BaP)は、DNA付加体形成による遺伝子毒性の要因となる発がん物質である。BaP DNA 付加体形成の主成分は7,8-diol-9,10-epoxy BaP(BPDE)であり、BaPがダイオキシン受容体（AHR）を介して誘導するCYP1A1が主要酵素であると言われてきた。しかし申請者らのCyp1a1遺伝子欠損マウスの結果は、CYP1A1以外の酵素の存在を明らかにした。だが分子の同定には至っていない。そこで本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的とする。目的達成には、変異原性のインディケーター試験にも使用されている32Pポストラベル法によるDNA付加体検出が必須であるが、この方法は時間とコストがかかる。そこで平成30年度から光センシングシステムの導波モードセンサーを利用した新たな簡便かつ迅速なDNA付加体検出法の確立を試みてきた。平成30年度において確立した方法は、シグナル値/ネガティブ値（S/N比）が低かった。令和1年では更に改良を行い、抗DNA抗体と抗BPDE抗体によるサンドイッチ法に変更し、ビオチン標識した抗BPDE抗体にストレプトアビジン-polyHRPを結合させAECの反応を増幅させることで、S/N比が改善した。またこの方法によってBaP処理したマウス肝臓および培養細胞のBaP DNA付加体を検出することができた。導波モードセンサーを用いてBaP DNA付加体を検出する方法を確立できた。しかしこの方法は定性的な測定方法であったが、1次スクリーニング法としては有用であると考える。現在、BaP DNA付加体に関与する新たな主要分子の探索を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、BaP DNA付加体形成の新しいメカニズムを解明することを目的としている。目的達成を実現するにあたり、DNA付加体検出をより簡便かつ迅速にする必要があると考え、H30年度において導波モードセンサーを利用した新たなDNA付加体検出法を確立することを試みたが、センサーチップにBPDE付加体含有DNAサンプルを固定しBPDE抗体と反応後、HRP-AECによる検出法ではS/N比が低値であるといった問題が生じた。そこで令和1年ではこの方法の改良を試みた。センサーチップに抗DNA抗体を固定し、BaP DNA付加体含有DNAと反応後、抗BPDE抗体を反応させるサンドイッチ法に変更し、更に検出法の改良として予めビオチン標識した抗BPDE抗体を用い、抗原抗体反応後、ストレプトアビジン-polyHRPを結合させAECの反応を増幅させ導波モードセンサーによって検出した。この改良した方法によってS/N比が改善し、平成30年度では検出できなかったBaP処理したマウス肝臓および培養細胞のBaP DNA付加体を検出することができた。導波モードセンサーを用いたBaP DNA付加体を検出する方法を確立できた。しかしこの方法は定性的な測定方法であったが、1次スクリーニング法としては有用であると考えられ、当初の計画を遂行することができた。現在原著論文の投稿準備中である。
平成30年度に計画より先行してDNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムの解明の為にポストラベリング法を用いBaP代謝への関与が報告されている酵素に対する阻害剤がDNA付加体形成を抑制することを見出した。そこで現在、阻害剤に対する分子のsiRNAを用い、DNA付加体形成の候補分子を探索している。現在までの進捗状況は導波モードセンサーによるBaP DNA付加体検出の確立に手間取った為、予定よりやや遅れていると評価した。

Strategy for Future Research Activity

１）DNA付加体形成分子の同定とDNA付加体形成メカニズムを解明する。
阻害剤に対する分子のsiRNAを用い、培養細胞系によってDNA付加体形成の候補分子を同定しBaP代謝産物およびDNA付加体をHPCLおよびUPLC/MS/MSによって解析し、新たなDNA付加体形成メカニズムを提示する。
２）DNA付加体形成に影響を及ぼすファイトケミカルの探索をする。
これまでの報告で同定した分子に対する阻害効果を示すファイトケミカルをスクリーニングの対象とし、ELISA法を用いた同定した分子の酵素活性の阻害効果、確立した簡易DNA付加体検出法用いたDNA付加体形成抑制効果を検討することで、DNA付加体形成を抑制する食品成分を検索する。次にin vivoでのファイトケミカルのDNA付加体形成および発がんへの効果を腺がん発症のモデル動物であるCyp1a1遺伝子欠損マウスを用い検討する。これら研究成果を原著論文として英文専門誌に報告する。