2019 Fiscal Year Research-status Report
Studies on intracellular and extracellular pathways involved in drug-induced pulmonary fibrosis
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18K06749
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
湯元 良子 広島大学, 医系科学研究科(薬), 准教授 (70379915)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 薬剤性肺線維症 / 肺胞上皮細胞 / 上皮間葉転換 / ERストレス / ATF3/4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
薬剤性肺障害、特に肺線維症の致死率は高く、極めて重篤な障害であるが、その発症機構を細胞・分子レベルで解析した報告は乏しい。本研究ではヒト肺由来細胞A549を用い、薬剤処置による細胞内経路を介した上皮間葉転換（EMT）誘発と細胞外分泌因子が関与するEMT誘発経路の両面から解析を進め、今年度は細胞外分泌因子としてactivating transcription factor 3 (ATF3)に着目し、EMTの指標であるα-smooth muscle actin (α-SMA)の発現変動との相関性について検討し、以下のような結果を得た。
１．肺障害性を有する抗がん剤メトトレキサート (MTX)、ブレオマイシンおよびTGF-β1でA549細胞を処置した結果、ATF3の発現は有意に増加し、TGF-β受容体阻害剤との併用によって、ATF3の発現は有意に抑制された。
2．セルクローニングによって得られたクローンA549細胞を用いて、MTXによるATF3とα-SMAのmRNA発現の増加率の二変量解析を行った結果、両者には比較的高い正の相関関係が認められたことから、MTXによるATF3の発現誘導が、MTXによるEMTの誘発に関連している可能性が示唆された。
3． Microarrayの結果をGene Ontology解析したところ、MTXによって小胞体（endoplasmic reticulum; ER）ストレス関連遺伝子の発現変動が統計学的に多いことが明らかになった。ERストレスによるPERK経路を介したATF4の活性化がATF3の誘導に関与していることから、A549細胞をERストレス誘発性薬物 thapsigarginで処置したところ、ATF4およびATF3のmRNA発現は増加したが、α-SMAのmRNA発現は有意に低下した。また、MTX処置によってATF4のmRNA発現に影響は認められなかったことから、MTXによるATF3誘導にERストレスは関与しない可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、転写因子であるATF3遺伝子の発現変動とEMT誘発の関連性に関して検討した結果、薬物誘発性肺障害に小胞体ストレスを介したATF3は関与していない可能性が示唆された。また、細胞内interleukin (IL) -6/8 mRNAの発現量およびIL-6/8タンパク質の培養液中への分泌量はMTX処置によって有意に増加するが、ENTを有意に阻害する葉酸の共処置によってIL-8タンパク質の分泌量は抑制されず、IL-6タンパク質の分泌量はTGF-β受容体阻害剤共存によって阻害されなかった。従って、IL6/8も薬物誘発性肺障害に関与していない可能性が示唆されたため、最終年度には薬物処置による遺伝子発現変動を再解析し、他の細胞外分泌因子の探索を行う予定である。
また、肺線維症モデル動物の作出についても引き続き行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現変動解析並びにバイオインフォマティクスの解析手法の一つとしてgene set enrichment analysis解析を行ったところ、新たな MTX誘発性EMTに関与する細胞外分泌因子として線溶系に関わる因子である plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) に可能性が認められたため、MTX誘発性EMTに対するPAI-1の役割について検討を行う。
2. 前年度に引き続き、肺線維症モデル動物（ラットおよびマウス）の作出を行う。BLM 、MTX、PTXの至適投与方法を決定し、肺線維症モデル動物の肺組織あるいは単離した肺胞上皮II型細胞からtotal RNAを抽出し、マイクロアレイ解析することによって、肺線維症発症による遺伝子発現変動が、EMT誘発培養細胞と同様にin vivoでも観察されるか否か検討する。
以上の検討により、肺障害性薬剤による肺線維症誘発に関わる分子機構を細胞内経路、細胞外経路の両面から解明するとともに、それに基づき新たな予防法や治療戦略を考察する。
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| Causes of Carryover |
研究はおおむね順調に進展しているが、新たな細胞外分泌因子の探索と肺線維症モデル動物の作出を次年度に移行させ、そのための研究費を次年度に繰り越した。
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[Journal Article] Association of cell cycle arrest with anticancer drug-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells.2019
Author(s)
Kawami, M., Harada, R., Ojima, T., Yamagami, Y., Yumoto, R. and Takano, M.
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Journal Title
Toxicology
Volume: 424
Pages: 152231
DOI
Peer Reviewed
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