2018 Fiscal Year Research-status Report
配糖体の体内動態を制御する促進拡散型トランスポーターの同定
| Project/Area Number |
18K06760
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
|---|
Principal Investigator |
井上 勝央 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (50315892)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | メラノーマ / 配糖体 / トランスポーター / グルコシダーゼ / GBA3 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜を介した配糖体の輸送活性を増幅して検出するために、βグルコシダーゼの一種であるヒトGBA3の哺乳動物細胞用発現ベクターの構築およびその安定発現株の作製を行った。GBA3をHEK293細胞に一過性に発現させ、βグルコシダーゼ活性を測定した結果、その活性は細胞質内だけでなく、培養液中にも認められた。このことから細胞内のGBA3は部分的に分泌されることが示唆された。そこでGBA3を細胞内に留めるために、小胞体局在化シグナルを有するcalnexin、アクチン結合性Lifeactおよびクロマチンの構成成分であるhistone H2Bを付加したGBA3およびそれらの発現用ベクターを作製した。これらGBA3付加体をHEK293細胞に発現させたところ、いずれも細胞内GBA3活性に対する細胞外GBA3活性が顕著に低いこと示された。calnexin-GBA3およびH2B-GBA3を発現するHEK293細胞安定発現株を作製し、4-methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (4-MU-Glc) を添加したときの加水分解により生成する4-MUの蛍光強度を評価した結果、4-MUの生成量は、GBA3活性だけでなく、4-MU-Glcの細胞膜透過量に依存することが示された。以上より、GBA3付加体を安定発現したHEK293細胞は、配糖体トランスポーターを評価するための遺伝子導入用ホスト細胞として利用できると考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、配糖体の輸送活性を増幅して検出するための評価システムを構築することを目標としており、その主要な項目は達成できたと考えることができるため、現在までの進捗状況はおおむね順調と判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度は、メラノーマ細胞株（A2058、G-361、Mewo）に細胞内局在性GBA3を安定発現させ、4-MU-Glc添加時に生成する4-MUの蛍光強度を定量し、蛍光強度の比活性（対細胞溶解液）が高い細胞株を選定する。配糖体の輸送活性が最も高いメラノーマ細胞において、mRNAの高発現が認められるトランスポーターおよびトランスポーター様遺伝子群を対象に配糖体に対する輸送活性を平成30年度に作製した評価系により検討する（遺伝子をHEK293/GBA3細胞に一過性発現させ、4-MU-Glcの輸送・分解に伴う蛍光強度を指標に配糖体輸送の活性スクリーニングを行う）。
|
