2018 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism and clinical prediction of drug resistance associated with epithelial mesenchymal transition of lung cancer
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18K06793
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| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
荻原 琢男 高崎健康福祉大学, 薬学部, 教授 (80448886)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 健太郎 高崎健康福祉大学, 薬学部, 講師 (40644290)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | P-gp / Snail / EMT / エンチノスタット / 薬剤耐性 / 肺がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
P-糖タンパク質（P-gp）は、様々な抗がん薬を基質として細胞外へ掃き出す排出系のトランスポーターであり、がん細胞における多剤耐性の原因のひとつとなっている。一方、がん細胞は上皮間葉転換（EMT）によって、浸潤および転移能を獲得し悪性化する。これまでに我々は、ヒト肺がん由来細胞であるHCC827細胞にSnail遺伝子を導入すると、EMTが誘導されるとともにP-gpの排出活性が増加することを明らかにしている。したがって、がんがEMTを起こしたときには、P-gpの機能亢進による薬剤耐性も獲得していることが示唆される。これらのことから、EMTおよびP-gpの機能亢進のいずれも抑制できる薬剤の開発が期待されるが、そのような薬剤は見出されていない。そこで本年度は、EMTを抑制することが確認されているヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤エンチノスタット（Ent）が、Snail誘発性のEMTおよびP-gp活性化を抑制するか否かを検討した。まず初めに、Snail導入によってE-カドヘリンのmRNA発現量の低下およびビメンチンのmRNA発現量の増加を確認した。これに対して、Ent処理ではSnailによるそれぞれの発現変動が抑制され、EMTが阻害されることが確認された。また、P-gp基質薬物であるローダミン123（Rho123）を用いた排出および取り込み試験において、P-gpの輸送機能も阻害されることが確認された。さらに、Entは対照細胞よりもSnail導入細胞のP-gpをより強く阻害した。これらのことから、EntがP-gpの基質となることが想定されたが、我々は少なくとも低濃度EntはP-gpを阻害するものの、基質として認識されないことを確認している。以上の結果から、Ent治療がSnail誘発性のEMTだけでなく、P-gpを介した多剤耐性をも抑制することを示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度では、ヒト肺がん細胞にSnailの遺伝子を導入することでEMT誘発性のP-gpの輸送機能亢進を引き起こし、その機能亢進のメカニズムおよび阻害方法について各種検討を行なった。まずEMT時のP-gpの輸送機能亢進メカニズムを明らかにするため、P-gpの膜上発現を支える足場タンパクであるEzrin、Radixin、Moesin (ERM) タンパクに注目し、ERMタンパクの発現量変化と輸送機能に対する影響を評価した。その結果、肺がん細胞においては、SnailによってERMタンパクの中でもMoesinの発現量が顕著に増加していた。これに対して、Moesinの遺伝子発現をsiRNAによって抑制したところ、Snailの導入によって亢進したP-gpの輸送機能はSnail未導入群と同程度にまで抑制された。したがって、肺がん細胞におけるP-gpの輸送機能亢進にMoesinが関与していることが示唆された(日本薬剤学会第34年会発表)。
また、阻害方法については、EMT抑制薬がP-gpの機能亢進をも抑制することが可能であれば、P-gp単独の阻害薬よりも有用であると考え、既存のEMT抑制薬を用いた検討をおこなった。まず、EMT抑制薬であるエンチノスタット (Ent) を用いて、Snail導入細胞に対する影響を評価したところ、EMTマーカーの発現抑制が確認されるとともに、浸潤能の低下が認められた。そこで、SnailによるP-gpの機能亢進に対するEntの影響を検討したところ、P-gp基質薬物の排出速度がEnt未処理と比較して有意に低下した。したがって、EMT抑制薬の中でもEntは、Snail導入によるP-gpの機能亢進に対する抑制作用を有することが示唆された (Tomono T. et al. PLoS One. 6;13(7):e0200015 (2018 ).)。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画どおり、まず肺がん細胞の足場タンパクを抑制したときのP-gpの機能変動におけるメカニズムを明らかにする。現在、足場タンパクのひとつであるMoesinの関与を示唆する結果を得ているが、その他のEzrinとRadixinが関与しているかについても検討していく。また、これらの足場タンパクの発現を抑制したとき、P-gpの機能が低下し、抗がん薬に対する耐性も減弱するかを細胞毒性試験により評価する。また、このときの細胞膜上におけるP-gpとERMタンパクの発現変動を評価する。さらに、ERMを活性化するリン酸化酵素群 (RhoA: Ras homolog gene family member Aなど) が、Snailによって誘導されるかをこれら酵素の阻害剤を用いて検討する。以上により、Snailによって誘発されたがん悪性化時のP-gpの機能亢進には、活性化されたERMタンパクによるP-gpの膜上発現誘導が原因となっていることを明らかにし、英文誌への投稿・受理を目指す。
以上の他に、P-gp以外の掃き出しトランスポーターであるmultidrug resistance associated proteins (MRPs) およびbreast cancer resistance protein (BCRP) の輸送機能変動も薬剤耐性の原因となるため、これらの輸送機能が亢進するかについてもP-gpと同様の手法により検討する。さらに、共同研究先である群馬がんセンターより提供いただいた肺がん患者の臨床検体を用いて、SnailとP-gpの発現を評価する。順調に検討が進めば、2019年度末までには足場タンパクあるいはその活性化因子のいずれかを抑制することで、悪性化したがん細胞の薬剤耐性克服方法を示すことができ、新規創薬標的を提案できるものと考えている。
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Research Products
(6 results)
