2018 Fiscal Year Research-status Report
核酸医薬品の細胞内取り込み/細胞内動態に関する分子基盤の解明
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18K06811
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
井上 貴雄 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 室長 (50361605)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 核酸医薬品 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、アンチセンスやsiRNAに代表される核酸医薬品の開発が進展しており、治療法のない遺伝性疾患や難治性疾患に対する次世代医薬品として注目を集めている。現状では、アンチセンス医薬を中心に8品目の核酸医薬品が上市されているが、その潜在的な課題として細胞内への送達効率が低い点が指摘されている。この課題に対して、オリゴ核酸を構成する核酸の化学修飾、オリゴ核酸の末端の修飾（脂質、糖などの付加）、送達キャリアの活用など、膜あるいは膜タンパク質との親和性を高める試みが行われているが、実用化の観点から更なる技術革新が望まれている。
我々はこれまでGFP mRNAを効率よく分解するGapmer型アンチセンスを核酸医薬品のモデルとして、その細胞内取り込み/細胞内動態に関与する遺伝子を「GFP発現細胞に対してGFP RNAを分解するアンチセンスを添加し、GFP蛍光をモニターするバイオアッセイ系」により探索してきた。本研究ではこの系を用いて、引き続き全ヒト遺伝子を対象としたRNAiスクリーニングならびに候補遺伝子の絞り込みを行う。さらに、候補遺伝子の遺伝子破壊細胞株の作製ならびにその性状解析を行う。
本年度は上述のヒト全遺伝子を対象とした網羅的RNAiスクリーニングを行い、1本鎖オリゴ核酸の細胞内取り込みならびに細胞内動態に関与する候補分子を網羅的に探索した。その結果から抽出されたヒット遺伝子の中から、細胞内取り込みに関与する可能性のある遺伝子を選定し、そのうち3種の遺伝子破壊株を作製した。遺伝子破壊株に対して、RNA分解型アンチセンスを導入試薬を用いない Free uptake 法により作用させたところ、全ての遺伝子破壊株において標的 RNA の分解活性の減弱が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は上述の通り、ヒト全遺伝子を対象とした網羅的RNAiスクリーニングを行い、1本鎖オリゴ核酸の細胞内取り込みならびに細胞内動態に関与する候補分子を網羅的に探索し、選定した3種の候補遺伝子の遺伝子破壊株の作製に成功している。作製した遺伝子破壊細胞株にRNA分解型アンチセンスを導入試薬を用いない Free uptake 法により作用させたところ、全ての遺伝子破壊株において標的 RNA の分解活性の減弱が確認された。この結果より、いずれの遺伝子もアンチセンスが細胞内に取り込まれてRNA分解活性を示すまでの何らかの過程に関与していることが示された。さらに、鎖長の異なったアンチセンスを用いた場合の挙動についての検討も行っており、当初の計画以上に順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、当該遺伝子の作用点及び基質特異性の特定を行う。当該分子がアンチセンスの細胞内取り込みや細胞内輸送におけるどのステップで機能をするかを明らかにする。具体的には、１）リポフェクトアミン、エレクトロポレーション等で導入したアンチセンスが機能するか、２）スプライシング制御型アンチセンスなど他の作用機序のアンチセンスが機能するか、３）1本鎖のアンチセンスのみならず、2本鎖の核酸医薬品（siRNA）が機能するか、等を解析する。また、当該分子を過剰発現させることにより、Gapmer型アンチセンスの作用を増強するかについても検討する。これにより、核酸医薬品の細胞内送達の律速となるKey moleculeを同定する。
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| Causes of Carryover |
本年度の計画していた検証事項は、予定していた研究費の最小限の範囲内で実施可能であったことから、次年度使用額が生じた。繰り越し分も含めた次年度使用額については、2019年度に実施する「1本鎖オリゴ核酸の細胞内取り込みならびに細胞内動態に関与する候補遺伝子の作用点及び基質特異性の特定」において実施する「異なった導入方法でのアンチセンスの機能検証」等の試薬類等に使用する。
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[Journal Article] 核酸医薬品の安全性評価に関する考え方 -仮想核酸医薬品をモデルにして- 第3回：既存情報の有効活用2018
Author(s)
木下潔,真木一茂,荒戸照世,太田哲也,小野寺博志,佐藤秀昭,中澤隆弘,平林容子,笛木修,三井田宏明,吉田徳幸,渡部一人,小比賀聡,井上貴雄
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Journal Title
医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス
Volume: 49
Pages: 207-214
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