2018 Fiscal Year Research-status Report

Studies on the physiological role of aquaporin-11 and molecular mechanism of cyst formation in aquaporin-11-deleted mice.

Research Project

Project/Area Number	18K06816
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	松崎利行群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30334113)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	向後寛群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20282387) 向後晶子群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20340242)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	アクアポリン11 / 精巣
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的の一つにアクアポリン11（AQP11）の機能を知ることがある。そのためには、ノックアウトマウスの腎臓以外の器官の解析も重要な知見となり得る。その一つが精巣である。しかし、これまで用いてきた全身のノックアウトマウスでは、腎臓の変化が大きく、生後4週間以内にほとんどが死に至るため、精巣の解析は困難である。そこで、精巣の解析をおこなうために、2018年度は精巣特異的なノックアウトマウスの作製に着手した。具体的には、パキテン期精母細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウス（RBRC02182：プロタミン1-Cre）とAqp11flxマウス（MMRRC037110-JAX）を入手し、交配を開始した。現在までにCre+;Aqp11flx/flxオスを得ることができ、解析を始めている。まず精子でAQP11がノックアウトされていることを確認するために、Cre+;Aqp11flx/flxオスと野生型メスの交配をおこなった。これまでにCre+;Aqp11flx/flxオス 4個体について交配をおこない、いずれも産仔を得ることが確認された。産仔の遺伝子型を確認することで、オス親マウスの精子でAQP11がノックアウトされたか否かが判定できる。すなわち、PCRでAqp11flxを有することが確認された仔は、ノックアウトされなかった精子が受精した結果であることがわかる。結果を「Aqp11flxを有する仔数／総産仔数」で表記すると、Cre+ Aqp11flx/flxオス 4個体からの産仔について、それぞれ0/9、0/4、0/4、2/20であった。以上から、Cre+;Aqp11flx/flxオスでは、Creリコンビナーゼが作用して、高い確率で精子のAQP11がノックアウトされていることがわかった。また、同時にAQP11がノックアウトされた精子でも産仔を得ることができることが判明した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 精巣特異的アクアポリン11ノックアウトマウスの作出にあたって、凍結精子、受精卵の入手が順調にすすみ、その後の交配も順調に進んだ。既に得ているAQP11のポリクローナル抗体は、特異性や検出力においてやや問題があるため、モノクローナル抗体の作製を計画していたが着手できなかった。2019年度はすぐに着手することとした。
Strategy for Future Research Activity	Cre+;Aqp11flx/flxオスの精巣上体から精子を採取して遺伝子型を確認したうえで、精巣の解析をおこなう。これまでの全身ノックアウトマウスの解析からは、精巣で精子が産生されて、精巣上皮から遊離する過程で遅れがみられるような結果が得られており、精子形成過程での形態学的な変化と完成した精子の形態を中心に解析を進める。また、腎臓での嚢胞形成機序を知るために、全身ノックアウトマウスでの腎臓の解析も進める。まずは、ノックアウトマウスでの腎臓尿細管細胞の変化を詳細にとらえる。とくに小胞体拡張から尿細管拡張、腎嚢胞形成までの機序に注目し、胎児期からの微小な変化を経時的に電顕で観察するとともに、アポトーシスマーカーや細胞増殖マーカーでの解析により、細胞の変化を観察する。細胞死や細胞増殖が起こる細胞種、時期を詳細に同定することで嚢胞形成機序の解明につなげる。おそらく小胞体が拡張した細胞がアポトーシスに陥って、いずれかの細胞が再生のために増殖して嚢胞を形成すると考えられる。また、発生段階でのAQP11の発現細胞の同定や局在解析が不十分であり、特に免疫電顕による細胞内局在を明らかにする必要がある。これまでウサギのポリクローナル抗体でAQP11の検出を試みてきたが、特異性や免疫電顕への適性でやや問題があり、今後の解析では使いにくいので、モノクローナル抗体の作製もおこなう。
Causes of Carryover	精巣特異的アクアポリン11ノックアウトマウス作製において、当初は、より多くの経費を見込んだが、順調に進んだため経費が抑えられた。また、モノクローナル抗体の作製も着手しなかったことから2019年度使用額として残った。2019年度はモノクローナル抗体の作製をおこなう他、動物維持数も増加する。