2019 Fiscal Year Research-status Report
内皮細胞の運動特性を基盤とする血管新生のメカニズムの解明
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18K06817
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
礪波 一夫 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (70511393)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 血管新生 / 血管内皮細胞 / 集団的細胞運動 / VE-カドヘリン / 回転運動 / 数理モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、血管新生における発芽伸長を可能にする内皮細胞特有の集団的細胞運動のメカニズムの解析から血管新生の仕組みを明らかにすることを目的としている。当該年度は、これまでマウス膵ラ氏島微小血管由来内皮細胞株MS-1の運動解析と数理モデルによる解析から明らかとした血管新生の基盤となる内皮細胞に特徴的な運動特性である、①細胞接触による方向性を示す運動の亢進と②回転運動を生み出す分子機構の解明に取り組んだ。CRISPR-Cas9システムにより、内皮細胞特有の接着分子であるVE-カドヘリン(CDH5)のノックアウト(KO)MS-1細胞を作出し、その解析結果から、上記運動特性の①はCDH5依存的な要素で、②はCDH5非依存的な要素であることが明らかとなった。次に①についてCDH5-GFP融合タンパク質の発現と細胞動態の解析から、CDH5の分布状態は幾つかのパターンに分類でき、その変化に対応するように接触したMS-1細胞の協調動態にも違いがあることが明らかとなった。また、Cdh5のKOにより細胞の足場となる接着斑の分布や関連分子の修飾にも変化が認められ、①の協調動態は、CDH5の機能変化による細胞間および細胞と細胞外基質間の調節を介して制御されている可能性が示唆された。②については、Cdh5のKOで内皮細胞に特徴的な回転運動が寧ろ亢進することから、コントロールMS-1細胞およびCdh5 KO MS-1細胞の遺伝子の発現についてRNA-seqを用いて解析し、回転運動に関わる候補遺伝子を選び出した。また、Cdh5 KO MS-1細胞の回転運動時のアクチン動態をLife-Actを用いて解析した結果、コントロールMS-1細胞では認められない、細胞接着面における葉状仮足の形成とラフリング現象の亢進が認められ、回転運動における低分子量Gタンパク質の活性制御の重要性を明らかにすることが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は、これまで明らかとしてきた内皮細胞の特徴的協調動態である、①方向性のある運動と②回転運動の分子機構についての解析に取り組んだ。①については、CDH5-GFP融合タンパク質の発現解析などから、CDH5が細胞接着面において連続的な分布をする時は２つのMS-1細胞が並行運動を、鋸歯状の分布を示す時は回転運動を示し、帯状に強く発現する際は運動が抑止される傾向があることが明らかとなった。また、ライブイメージングによる解析から、細胞の運動方向の前方においてCDH5のエンドサイトーシスが認められたことから、CDH5の局在や機能の変化が内皮細胞特有の運動パターンを制御している可能性が示された。加えて、Cdh5 KO MS-1細胞の分子動態の詳細な解析から、Cdh5のKOにより細胞の接着斑を構成する分子の分布や分子修飾が変化しており、CDH5が細胞と細胞外基質との接着状態も制御し得ていることが明らかとなった。②については、RNA-Seqを用いたコントロールMS-1細胞とCdh5 KO MS-1細胞の遺伝子発現解析から、回転運動に関わる分子の候補として、カドヘリンファミリー分子を含むCDH5以外の細胞間接着分子やCdh5 KO MS-1細胞で発現低下が認められたNF- kBシグナル伝達経路の下流分子に着目し、現在これらの候補分子のKO細胞の作出に取り掛かっている。さらに、Cdh5 KO MS-1細胞の回転運動に細胞接着面における低分子量Gタンパク質の活性制御の重要性が明らかになったことから、低分子量Gタンパク質の活性経路の幾つかを阻害する試薬を用いて、回転運動に重要な分子とその活性を探索しているところである。以上当該年度は当初の研究計画通りに進展したが、回転運動に関わる新規分子の同定にまでは至らなかったため、概ね順調と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究方針としては、①CDH5に依存した方向性のある運動と②CDH5に依存しない回転運動について各々の分子機構を詳細に解明していくことである。①については、内皮細胞の特徴的協調運動パターンを生み出すCDH5の分子機能の変化について、特にエンドサイトーシスとの関連に着目した解析を進める。具体的には、Cdh5 KO MS-1細胞に、細胞内へのエンドサイトーシスが抑制されるCDH5変異体（DEE変異体）と野生型CDH5によるレスキュー実験を行い、両者の細胞動態の比較からCDH5のエンドサイトーシスによる機能変化あるいは量的変化が内皮細胞の特徴的協調動態にどの様な役割を担っているかを明らかにする。また、CDH5が接着斑の機能にどのような影響を与えるのかも明らかにする。具体的には、Cdh5 KO MS-1細胞と野生型細胞の比較により、CDH5による接着斑形成に関連する分子の修飾（主にリン酸化）をモニタリングする。②については、回転運動に関わる分子の同定からその分子機構の解明を進める。既に、コントロール細胞およびCdh5 KO MS-1細胞を用いた遺伝子発現解析の結果から、回転運動に関わる候補分子としてカドヘリンファミリー分子を含む細胞接着分子（4個）やNF- kBシグナル伝達経路の下流分子（2個）に着目しており、これらの分子のKO MS-1細胞の作出に着手している。今後は、これらのKO MS-1細胞の動態や発芽的血管新生現象を詳細に解析し、回転運動および発芽伸長における役割を明らかにしたい。また、回転運動における低分子量Gタンパク質の活性制御も明らかにしており、既に幾つかの低分子量Gタンパク質活性阻害剤により、回転運動が減弱することを確認している。今後は、その上流分子の解析も含め、どのような機構で活性制御されているのかを明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
前年度の実験が当初の計画以上に進展し、細胞動態解析やRNA-Seqの実験データを前年度中に多く取得することができた。そのため、当該年度はそれらのデータ解析の作業や数理モデルと実験データとの照らし合わせ・修正といったドライの解析が中心となり、ウエットの実験に用いる物品費の支出が予定より下回ることとなった。次年度は本研究の論文投稿を予定しており、校閲や投稿費用、さらに追加実験等により、これまでより大幅な出費を伴う可能性が想定される。以上の理由から、当該年度に使用しなかった研究経費を次年度に繰り越すことにより、次年度の研究成果の発表にかかる出費に対して弾力的な対応が可能となり、研究計画全体の進捗にとって建設的であるため次年度の使用が生じることとなった。
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Research Products
(5 results)
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[Presentation] 単一細胞遺伝子発現ネットワークの分析による血管新生調節機構の解析2019
Author(s)
内島泰信, 戸澤英人, 岩瀬晃康, 礪波一夫, 田久保直子, 栗原由紀子, 田口明糸, 椎名香織, 小林美佳, 山本尚吾, 仲木竜, 興梠貴英, 油谷浩幸, 和田洋一郎, 栗原裕基
Organizer
第42回日本分子生物学会年会
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