2018 Fiscal Year Research-status Report
成長円錐における局所的蛋白合成と細胞骨格の動態との関係解析
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18K06818
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
星 治 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (10303124)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武井 延之 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372)
長 雄一郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (90334432) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 成長円錐 / 原子間力顕微鏡 / アクチンフィラメント / チュブリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
伸長中の神経突起の先端に存在する成長円錐は、手のひらをひろげたような扇形をしており、神経発生や神経再生の過程で重要な機能を有している。成長円錐が標的細胞を見出してシナプスを形成する過程は軸索ガイダンスと呼ばれ、神経回路網の形成において大切な現象である。
近年、成長円錐に存在する分子、成長円錐が感受するガイダンス因子、誘発因子、反発因子などが明らかにされ、成長円錐の運動に関係する分子のはたらきが明らかにされてきた。さらに、局所的な蛋白質合成が神経細胞の機能に関わることが明らかになり、なかでも発達期の成長円錐では局所で蛋白質合成が起こり、成長円錐の方向性を変える機能に関与することが示唆されている。局所翻訳される蛋白質として、Rhoなどの細胞骨格制御因子のほかミトコンドリア機能の調節因子などが報告されている。しかし、翻訳（リボソームおよび翻訳因子群）によって局所的蛋白質合成が起こっている部位と細胞骨格との相互作用については不明である。この相互作用の解明は、成長円錐の転向運動のメカニズムを理解する上で重要である。
本研究では、刺激に伴う成長円錐における局所的蛋白質合成と、微小管やアクチンフィラメントとの相互関係を形態学的に明らかにする方法を開発するために、細胞膜剥離法と原子間力顕微鏡を用いて成長円錐部分の細胞成分の新たなイメージング方法の検討を行った。
その結果、細胞膜剥離処理をした成長円錐部分のアクチンフィラメントとチュブリンを蛍光免疫染色により標識し、同一部位を蛍光顕微鏡と原子間力顕微鏡で観察することに成功した。このイメージング技術を基盤にして、局所的蛋白質合成に関係するリボソーム蛋白質や翻訳装置なども蛍光標識することにより、蛋白合成部位と細胞骨格との相互関係を、今後形態学的に明らかにできる可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、超音波による細胞膜剥離法（unroof method）により成長円錐部分を処理し、内部の構造を原子間力顕微鏡（AFM; Atomic force microscopy）と蛍光顕微鏡を相補的に用いて、細胞骨格蛋白質分子のイメージングを試みた。
その結果、成長円錐内部のアクチンフィラメントとチュブリンの局在とそのナノレベルの微細構造解析が可能であることが明らかとなった。この方法を基盤にすれば、成長円錐における局所的な蛋白質合成と細胞骨格との相互作用の3次元的な構造解析が可能であることが示唆されたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題を遂行する上で、原子間力顕微鏡による観察では、いくつかの限界がある。具体的には、成長円錐部分の細胞骨格成分の詳細の同定が困難であったり、局所的タンパク合成部位の同定についても、蛍光標識して、蛍光顕微鏡を併用しても困難な場合がある。今後は、このような限界点を克服するために、細胞膜剥離フリーズエッチングレプリカ法（unroofing freeze-etching replica)も用いて、細胞骨格と局所的蛋白合成部位の空間構造の解析を電子顕微鏡によっても行っていく方針である。
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