成長円錐における局所的蛋白合成と細胞骨格の動態との関係解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06818
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 星 治 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (10303124)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武井 延之 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372) ; 長 雄一郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (90334432) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 成長円錐 / 局所的蛋白合成 / 細胞骨格

Outline of Annual Research Achievements

神経細胞においては、細胞体から離れた部位において、刺激に対する構造・機能変化が必要である。そこでは、局所的蛋白合成が重要なはたらきをしており、なかでも発達期の成長円錐では、その運動方向性に関与していることが報告されている。局所翻訳される蛋白質としては、Rhoなどの細胞骨格制御因子のほか、ミコトンドリア機能の調節因子などがある。しかし、翻訳装置（リボソームおよび翻訳因子群）によって局所的蛋白合成が起こっている部位と、細胞骨格がどのように相互作用しているかについては不明であり、その相互作用の解明は、成長円錐の転向運動のメカニズムを理解する上で重要である。
本研究では、成長円錐における局所的蛋白合成と細胞骨格との相互作用の解明を明らかにすることを目的に、2020年度は主に超解像顕微鏡を用いて、成長円錐部分のイメージング方法の検討を行った。具体的には、リボゾームタンパクP0/1/2とactin filanentに対して免疫組織化学染色を施し、超解像顕微鏡により観察した。その結果、リボゾームタンパクP0/1/2とactin filamentは共局在している傾向が認められた。リボゾームタンパクS6とactin filamentについても同様の傾向にあった。さらに、tubulinとリボゾームタンパクP0/1/2およびS6リボゾームタンパクについても、それぞれ免疫組織化学染色を施し観察したところ、染色態度が良好でなかったため、抗体の希釈率などの染色条件の検討を今後していく必要があることがわかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ラット脊髄後根神経節細胞を初代培養し、成長円錐部分に対し、細胞骨格についてはactin filamentおよびtubulinを免疫染色し、リボゾームタンパクについてはP0/1/2とS6をそれぞれ免疫染色して、超解像顕微鏡により観察した。その結果、actin filamentとリボゾームタンパクP0/1/2は共局在している部分が多く、S6リボゾームタンパクも同様にactin filamentと共局在している傾向が認められた。なお、tubulinについては、染色態度を改善するべく、抗体の希釈率などの条件を今後さらに検討する必要がある。また、リボゾームタンパクについては、さらにリン酸化型S６やL４など他の種類のものでも成長円錐における局在を調べる必要がある。以上より、当初の計画より進捗はやや遅れた状況にある。

Strategy for Future Research Activity

2020年度は超解像顕微鏡による観察の結果、成長円錐において、actin filamentとリボゾームタンパクP0/1/2およびS6リボゾームタンパクはいずれも共局在している傾向が認められた。今後、この点については画像解析ソフトも利用し、定量的な解析を行う予定である。また、細胞骨格についてはtubulinを、リボゾームタンパクについてはリン酸化型S6、L4なども免疫染色して、その局在について解析する予定である。さらに、成長円錐をBDNFなどで刺激して、蛋白合成を活発な状態にさせた場合に、細胞骨格とリボゾームタンパクの局在の関係がどのように変化するのか、今後解析していく予定である。

Causes of Carryover

2020年度内に研究代表者が所属する機関の所在地（東京）に、2回の緊急事態宣言が発出されたため、当初計画していた実験・研究の実施を一次中断せざるを得ない状況となり、一部の実験を2021年度に行うことになったため。