2019 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of the mechanism of contractile ring formation by single molecule fluorescence polarization imaging
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18K06819
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アクチン / 蛍光偏光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①II型ミオシンに対する蛍光偏光プローブの評価：前年度に作製したII型ミオシン蛍光偏光プローブを、哺乳類細胞に安定発現させるためのコンストラクトを作製し、それを使ってブタ腎尿細管上皮由来細胞株で安定発現細胞株を作製した。プローブは緑色蛍光と赤色蛍光の二種類を作製し、評価したが、赤色蛍光偏光プローブの性能が緑色蛍光のものに比べて低かった。開発済みのアクチン蛍光偏光プローブは緑色蛍光であるため、アクチンとⅡ型ミオシンの同時蛍光偏光イメージングのために、II型ミオシン赤色蛍光偏光プローブの性能改善、もしくは赤色蛍光のアクチン蛍光偏光プローブの作製が必要であることが明らかとなった。
②II型ミオシンに対する赤色蛍光偏光プローブの性能改善、赤色蛍光のアクチン蛍光偏光プローブの作製：①に述べた状況に対応するため、II型ミオシン赤色蛍光偏光プローブの性能改善、およびアクチン赤色蛍光偏光プローブの新規作製を同時進行で行った。新たな赤色蛍光タンパク質の使用により、両者ともに、少なくともアンサンブルでは良好な蛍光偏光プローブとしての性能を示すものを作製することができた。次年度に一分子レベルでの性能評価を予定している。
③分裂酵母でのアクチン蛍光偏光プローブ発現の検討：前年度に、nmt1プロモーターによる発現誘導により適切なプローブ発現条件を見出すことに成功していたが、共同研究先で同様に実験したところ、培養装置の違いなどから、申請者の研究室での発現誘導を再現することが困難であった。再現の容易な発現系の構築が必要と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
II型ミオシンに対する赤色蛍光偏光プローブの性能が想定より低かったため、それに対応する必要が生じた。結果的に性能の良い代替プローブを作製することができたため、蛍光偏光観測実験については影響を最小限にとどめることができ、当初の計画通りに実験を進める予定である。一方で生化学実験については、今年度に行う予定だった実験に着手できず、次年度に行うことになった。また、分裂酵母での発現系についても再検討が必要であると判明し、これについても次年度に行うことになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
哺乳類細胞におけるアクチンとⅡ型ミオシンの同時蛍光偏光イメージングについては、新たに作製したプローブを用いて当初の計画通り進める。分裂酵母についても、発現系を確立したのち、当初の計画通り蛍光偏光イメージングを行う。生化学実験については、改変型BioID酵素を使ったスクリーニングの条件検討を進め、適切な条件が定まり次第、スクリーニングを開始する。
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| Causes of Carryover |
COVID-19の影響により、発表予定だった学会が誌上開催となり、その目的で計上していた旅費が不要になったため。進行が遅れている実験計画を加速させるための用途に切り替えて対応する予定である。
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