2020 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of the mechanism of contractile ring formation by single molecule fluorescence polarization imaging
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18K06819
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アクチン / ミオシン / 収縮環 / 蛍光偏光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①アクチンの配向解析に用いるアクチン蛍光偏光プローブPOLArISactの性質の解析を行った。生化学的実験から、POLArISactは単量体アクチン（G-actin）にはほとんど結合せず、繊維状アクチン（F-actin）に特異的に結合することがわかった。また、F-actinに結合する際、POLArIS分子とアクチン分子の量比はほぼ1:1となることが分かった。クライオ電子顕微鏡で結合様式を解析しようとしたが、GFP部分は想定以上に揺らぎが大きく、可視化されなかった一方で、アクチン結合Adhiron部分は高分解能で可視化され、他の汎用されるF-actinプローブであるLifeActやUtrCHと結合部位が重複することが明らかとなった。細胞に発現させ、生きたまま蛍光顕微鏡観察する実験では、LifeActやF-tractinと比べて細胞質のバックグラウンド画分が少なく、より高コントラストでF-actinが可視化されることが分かった。またUtrCHとは同程度のコントラストであったが、ラメリポディアのアクチンへのpreferenceは異なることが分かった。
②非筋ミオシンIIに結合する蛍光偏光プローブについては、性質解析のために安定発現株の作成を行った。RNAiを用いた非筋ミオシンIIアイソフォームのノックダウンにより、特異性を確認しようとしたが、最初に用意したノックダウン効率を確認するための抗体の感度が悪く、抗体を選定しなおす必要が生じた。抗体の選定までは進めることができたが、特異性の確認実験は完了していない。
③今後、非筋ミオシンIIの性質解析を完了させ、POLArISactと非筋ミオシンIIの蛍光偏光プローブを用いて、収縮環ダイナミクスの解析を行う予定である。
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