2018 Fiscal Year Research-status Report
Molecular and functional analysis of a novel endocytic pathway associated with macropinocytosis
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18K06831
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
荒木 伸一 香川大学, 医学部, 教授 (10202748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
江上 洋平 香川大学, 医学部, 講師 (80432780)
川合 克久 香川大学, 医学部, 助教 (80534510)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / 膜輸送 / Rabタンパク質 / PI3キナーゼ / マクロパイノサイトーシス / ライブセルイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、マクロパイノサイトーシスから派生する Rab10 陽性管状構造を Rac1 光制御で選択的に誘導し、その形態及び分子局在の特徴から新規エンドサイトーシス経路としての存在とその分子基盤を確立することを目的とする。
RAW264 マクロファージ様培養細胞に photoactivatable-Rac1(PA-Rac1, LOV融合-Rac1Q61L)ないし PHR-iSH―PI3K を核内遺伝子導入で発現させ、Rac1とPI3Kを顕微鏡下オプトジェネティクスで活性化し、それによって誘起されるマクロパイノサイトーシス過程を比較解析した。RFP-Rab10 との共発現系ライブセルイメージングで Rab10 陽性となるものとならないものを経時的に追跡した結果、PI3Kの活性化により誘起されたマクロパイのサイトーシスでは、初期のマクロパイノサイティックカップにはRab10がリクルートされず、そのままマクロパイノゾームが形成されたが、Rac1活性化により誘起したものはマクロパイノサイティックカップがRab10強陽性となりそこからRab10陽性の管状構造が伸張し、マクロパイノゾーム自身は小さくなって消失した。
また、RAW264細胞にPKC活性化剤であるPMAを添加した場合にも、通常のマクロパイノサイトーシスが誘起されるが、PI3K阻害剤のwortmannin存在下でPMAを添加した場合は、典型的なマクロパイノゾームはできずPA-Rac1で誘起の場合とよく似たRab10陽性管状構造が多数見られた。このことからRab10陽性のエンドサイトーシス経路は、PI3K非依存性でRac1活性化により誘起され、PI3Kの阻害状態でより亢進することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画通り、マクロパイノサイトーシスから派生する Rab10 陽性管状構造を Rac1 光制御で選択的に誘導し、PI3K活性の光制御によるもの、PI3K阻害剤存在下での場合とも比較検討して、PI3K非依存性の新規エンドサイトーシス経路の存在を明確にすることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の結果を受けて、まずPI3K抑制下でRab10陽性のエンドサイトーシス経路が亢進する理由を解明したい。異なるPI3Kクラスに対する特異的な阻害剤を用いRab10陽性エンドサイトーシス経路への影響を見る。また、PI(3,4,5)P3などのホスフォイノシチドを可視化し、管状構造形成との関連を探る。Rab10のRNA干渉により管状構造形成や輸送への影響を明らかにしてゆく。
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| Causes of Carryover |
過年度に購入した消耗品のストックを消費し、新規の消耗品購入を遅らせた。蛍光顕微鏡のランプ交換なども次年度に繰り下げている。次年度には、これらの出費が必要となる。
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Research Products
(3 results)
