2019 Fiscal Year Research-status Report
大脳皮質ニューロンのネトリン-1に対する反応が発生段階に依存する機構の解明
| Project/Area Number |
18K06839
|
|---|
| Research Institution | Saitama Medical University |
|---|
Principal Investigator |
松本 英子 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (00312257)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 神経回路形成 / 大脳皮質ニューロン / 軸索ガイダンス / 軸索側枝形成 / ネトリン-1 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
多機能性の軸索ガイダンス因子ネトリン-1に対して発生期の大脳皮質ニューロンが示す反応には、軸索伸長と軸索側枝形成がともに知られている。マウス初代分散培養を用いた我々の過去の研究では、材料として使用する胎仔の発生段階の違いにより、ネトリン-1刺激の際に軸索伸長反応と側枝形成反応のいずれかがそれぞれ別に認められ、大脳皮質ニューロンのネトリン-1に対する反応が発生段階に依存する可能性が考えられた。しかしながら大脳皮質ニューロンが種々の細胞集団から成ることに注目すると、上記の結果は大脳皮質ニューロンを総体として見た際の反応に過ぎないともいえ、ある細胞集団がその性質を変化させたことを示すものか否かは不明である。そこで本研究では軸索伸長反応／側枝形成反応を示す細胞集団を特定しこの点を明らかにした上で、発生段階による差違を生ずる機構の解明を目指す。
研究計画2年目となる今年度は脳梁交連ニューロンの解析に着手した。大脳皮質の発生の際には遅生まれのニューロンほど表層側に配置されることはよく知られているが、脳梁交連ニューロンは誕生時期の異なる細胞集団を含んでおりⅡ/Ⅲ層、Ⅴ層、Ⅵ層に存在することが報告されている。そこでチミジンアナログEdUを胎生期の様々な時期に投与し、これが増殖細胞中の新生DNAに取り込まれることを利用して脳梁交連ニューロンを誕生時期毎にさらに区分したうえで、ネトリン-1に対する反応の解析を行いたいと考えた。
まずⅡ/Ⅲ層ニューロンに注目し、胎生15日 (E15) におけるEdU投与でその標識を試みた。E15マウスに単回投与を行い、E16において大脳皮質を初代分散培養に供すると、EdUにより標識されたニューロンが確認された。この試料で脳梁交連ニューロンのマーカーによる免疫蛍光染色を行ったところ、脳梁交連ニューロンマーカー陽性かつEdU陽性を示すニューロンが少数認められた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
脳梁交連ニューロンのうち、誕生時期の異なる各細胞集団が軸索伸長反応／軸索側枝形成反応を示すか否かを明らかにする目的で、EdUを様々な時期のマウス胎仔に投与し、脳梁交連ニューロンマーカー陽性かつEdU陽性となった細胞について定量的画像解析を進めることを当初より予定している。これまでに試みた実験条件の下では該当するニューロンが少数のみ認められていることから、EdU標識の方法にさらなる検討を加え、誕生時期毎の解析を行う際の適切な区分を見いだすことを目指しているところである。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず第一に、大脳皮質Ⅱ/Ⅲ層に存在する脳梁交連ニューロンが軸索伸長反応／軸索側枝形成反応を示すか否か、さらに追究する計画である。EdUの単回投与では、脳梁交連ニューロンマーカーとEdUによって二重に標識された細胞は少数しかみられず、解析が困難であった。そこで今度は、EdUを所定の間隔で複数回投与し累積取り込みの検出を行うことで、より長時間のEdU標識を試み、誕生時期による区分が解析可能なものとなるような条件を探る予定である。
次いで、発生過程のより早い段階においてEdU投与を行うことによって大脳皮質Ⅴ層およびⅥ層のニューロンを標識し、これらの層に存在する脳梁交連ニューロンについても、軸索伸長反応／軸索側枝形成反応を示すか否かを調べることを計画している。
|
| Causes of Carryover |
EdUの投与時期を様々に変えたうえで、脳梁交連ニューロンマーカー陽性かつEdU陽性となったニューロンに注目し、定量的画像解析によりそれらで軸索伸長反応／軸索側枝形成反応がみられるか否かを調べることを計画している。当初は先述の通り、EdUの単回投与についてこれを実施することを予定していたが、その場合E15における投与では該当する細胞が少数であることが判明したため、現在EdU標識の方法について再検討を行っている。おもにこの影響により、次年度使用額が生じることとなった。
次年度使用額と令和2年度請求分とを合わせ、実験動物・消耗品・機器の購入、ならびに研究成果の発表のための費用に充てる考えである。
|
