2019 Fiscal Year Research-status Report

造血微小環境におけるストローマ細胞の構成様式と造血支持機能

Research Project

Project/Area Number	18K06846
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	相沢信日本大学, 医学部, 教授 (30202443)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	細胞・組織 / 老化促進マウス / マクロファージ / ストローマ細胞 / 三次元培養 / 造血微小環境 / サイトカイン / 細胞周期
Outline of Annual Research Achievements	造血現象は造血幹細胞という「種」が、造血微小環境という「畑」において育つ過程を示すものである。本研究は畑である造血微小環境の構成要素としてのストローマ細胞に注目し、これら細胞がどの様に造血幹細胞の増殖・分化に関わりを持って機能しているかをin vivo骨髄標本を用いて解析し、さらに三次元培養法を用いたin vitroの面からも検証することにより造血制御機構を解明することを目的としている。研究初年度は、ストローマ細胞に機能障害を有する老化促進モデルマウス(senescence-accelerated mice:SAM)と正常マウスとの比較検討により、外的ストレス(LPS投与)時のストローマ細胞、特にマクロファージの亜群の存在様式を経時的に観察し、造血制御機能の解析を行った。この結果ストローマ細胞を介した生体の恒常性維持機能の破綻が造血器障害の一因となっていること、また機能的マクロファージへの分化異常がその破綻の一因であることを明らかとした。引き続き令和元年度は、ストローマ細胞による造血制御機構について、三次元培養を用いたin vitroでの造血細胞との共培養法システムにより検討した。特性の異なる骨髄由来ストローマ細胞を分離し、それぞれ固有の三次元培養法を構築し、造血細胞との共培養系を用いて比較検討した結果、造血幹細胞は存在するストローマ細胞により細胞周期の制御を受けながら増殖・分化の制御を受けている結果が得られた。SAMマウスでは、通常状態ではこの制御機構が正しく機能している事が確認されたが、外的ストレスの際には制御が破綻し、恒久的に造血現象が維持されるために必要な造血幹細胞の細胞周期バランスの維持に混乱が生じていることが明らかとなった。これらの結果よりストローマ細胞は環境変化にも対応しながら恒常性を維持するために、造血制御の主役として機能していることが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 初年度に引き続き、令和元年度研究も研究予定に沿って研究が遂行できており、遅滞、変更は特にない。具体的には特性の異なる骨髄由来ストローマ細胞を分離し、それぞれin vitro三次元培養法を構築し、造血細胞との共培養系を確立した。本培養系における造血細胞の動態として増殖・分化をフローサイトメトリー等を用いて定量的に、経時的に比較解析することにより、ストローマ細胞の造血支持機能の客観的評価を可能とした。またin vivoではlipopolysaccharide(LPS)投与等を用いた生体への外的ストレス負荷モデルを用いた検討により、骨髄ストローマ細胞の存在様式についてモノクローナル抗体を用いた方法による免疫組織学的解析も進行しており、特に造血組織内のマクロファージの亜群については、増殖・分化動態の検討など、さらに詳細を検討中である。これら研究成果をもとに、令和2年度は計画最終年度として研究成果の解析、総括も念頭に進行中であり、研究計画は順調に進行している。
Strategy for Future Research Activity	最終年度である令和2年度は、in vivoおよびin vitroでの造血微小環境の役割についてさらに検討を重ね、特に造血微小環境の造血幹細胞周期の制御機構の詳細を検討する。このためにLPS投与など外部刺激によるストレス下におけるマクロファージ、線維芽細胞、脂肪細胞などストローマ構成細胞それぞれの存在様式および量的、質的動態の変化を免疫組織染色、フローサイトメトリーを用いて検討し、構成細胞それぞれの機能的特性を明らかとする。造血幹細胞を保護し、個体としての恒常性を維持するためのシステムの存在については細胞周期変動の詳細をさらに検討し、ストローマ由来の造血細胞周期関連因子の特定を行う。そのためのストローマ細胞を個々に分離、純化して培養し、サイトカインなど液性因子の産生などについて観察する方法はすでに確立されている。また研究最終年として、三次元培養、ストローマ細胞分離培養法を用いて、ストローマを構成する細胞個別の特性を検討し、造血現象に果たす役割を明確化する。これら研究結果については解析、総括し、公表準備中である。