2019 Fiscal Year Research-status Report
人工RNA結合タンパク質によるRNA定量・制御法の開発と総和RNA量の機能解析
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18K06848
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高井 啓 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (60637205)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有吉 哲郎 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (00782103)
池田 一穂 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (20642565)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | RNA / ライブイメージング / 遺伝子発現 / 発生生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度では、人工RNA結合タンパク質と蛍光タンパク質を融合したものをmRNA可視化プローブとして用いていた。本年度ではまず、より高感度かつ高精度なmRNA可視化法の作製に取り組んだ。初めに蛍光タンパク質部分をSunTagシステムに置き換え、シグナルの高感度化を図ったところ、シグナル強度は改善したがバックグラウンドシグナルも高いという結果になった。次にSunTagシステムの替わりにGFP11tagシステムを用いてシグナルの高感度化とバックグラウンドの低減を図ったところ、高感度かつ低バックグラウンドの良好なイメージングデータが得られた。一方、異なったアプローチとして、プローブそのものにタンパク質不安定化配列を融合して過剰なプローブ量を低減させたところ、バックグラウンドの低減が認められた。加えてプローブの発現システムにリプレッサーシステムを導入し、過剰にプローブが発現するとそのプローブに融合したリプレッサーがプローブそのものの発現を抑制するフィードバックシステムを導入したところ、一定のバックグラウンドの改善効果が認められた。今後はこれらの方法を組み合わせ、より高感度かつ低バックグラウンドのmRNA可視化法を確立していく。
次にmRNA可視化プローブが、結合したmRNAの発現量に影響しないかどうかを定量PCR法によって確認した。その結果、作製したほとんどのプローブは標的mRNAの発現量に影響しないことが確認できた。一方でプローブが生細胞において標的mRNA特異的に結合しているかどうかを、プローブを発現した細胞の溶出液からの免疫沈降法と定量PCR法を組み合わせて検討した。その結果、本プローブは生細胞内において標的mRNA特異的に結合することが示された。以上より本プローブは、生細胞内の標的mRNA発現量には影響せず、生細胞内において標的mRNA特異的に結合することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
少しずつではあるが良好な結果が蓄積しており、概ね順調に成果が得られているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題の進捗状況は概ね順調であるため、次年度も予定通り計画に沿って研究を推進する。
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| Causes of Carryover |
消費税増税等による消耗品の価格改定やCOVID-19感染拡大の影響などにより予定通り計画を推進できない部分があり、若干の端数が生じた。また、額面も少額であるため、使用計画は大きく変更しない。
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