2019 Fiscal Year Research-status Report
Mechanisms of ATP-release in Cancer Cells
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18K06851
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
古家 喜四夫 名古屋大学, 総合保健体育科学センター, 研究員 (40132740)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ATP放出 / ルミネッセンスイメージング / がん微小環境 / 乳がん細胞 / 低張刺激 / S1P / VRAC / LRRC8A |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんは自らの周りに生存を維持するための微小環境を構築しており、そこにはATPが高濃度で存在する。このATPの大きな役割は分解によりアデノシンを生成、高濃度に維持することにより、がんに対する免疫攻撃を抑制することである。しかしがん微小環境においてATPが高濃度に維持されるメカニズムは分かっていない。本研究は、私たちの開発したATPリアルタイムイメージング法を用いて見出すことのできたがん細胞特異的なATP放出現象の機序と役割を明らかにし、がんにおけるATPシグナリングを解明することを目的としている。これまでに、低張刺激によって未分化の細胞株特異的に散漫的持続的なATP放出がみられ、それが容量調節性Cl-チャネル(VRAC)の阻害剤であるDCPIBでのみ阻害されたことから、VRACががん細胞におけるATP放出経路であるとの仮説を立てた。このATP放出は低張刺激だけではなく炎症性物質Sphingosine-1-Phosphateで細胞容積変化を伴わずに活性化され、またがん微小環境に多く存在する上皮間葉系転換を引き起こすTGFβ処理によって増大することも分かった。さらにVRACの分子実体であるLRRC8 (Leucine-rich repeat-containing protein 8)ファミリー(AからE)が乳腺細胞株に発現しており、ATP放出を増強させるTGFβ処理によってその発現量が増えることを明らかにした。本年度はVRACの必須サブユニットであるLRRC8Aのノックダウン実験を、siRNAによる一時的な発現阻害、アデノウィルスを用いたshRNAの恒常発現株細胞作製によって行った。どちらによってもLRRC8Aノックダウン細胞において、低張刺激、S1P刺激による散漫的持続的ATP放出は抑制されVRACの関与が確証された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
低張刺激によってがん細胞において正常細胞とは異なったATP放出機序の違いを見出し、それは容量調節性Cl-チャネル(VRAC)の阻害剤であるDCPIBで阻害され、炎症性物質Sphingosine-1-Phosphateで細胞容積変化を伴わずに活性化されること、VRACの分子実体であるLRRC8Aと8Bから8Eのサブファミリーが乳腺株細胞に発現していることなどからVRACと考えられた。そのことを、LRRC8AをsiRNAによる一時的な発現阻害、アデノウィルスを用いたshRNAの恒常発現株細胞作製によるノックダウン実験を行い、ATP放出が抑制されたことによって確証した。ほぼ当初の計画どおり順調に進んでいるということができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
低張刺激およびS1P刺激による未分化細胞特異的なATP放出機序はVRACの主要構成分子であるLRRC8Aのノックダウンによって抑制されることを明らかにしたが、そのisoformsであるLRRC8B-Eの寄与は明らかではない。これらisoformsのノックダウン実験でATP放出との関連を確認していく必要がある。特にA,C,Dの発現量が多く、中でもLRRC8CはATP放出量を増大させるTGFβ処理によって明らかに増大し、VRACのATP放出能との関連が深いと考えられる。また等張条件下においてATP放出を誘起するS1Pはがん微小環境にも多く存在することからがんにおけるATP放出に深く関与している可能性がある。S1P受容体の関与とVRAC活性化の機序を明らかにしていくことも必要と考える。また正常乳腺細胞の多様なATP放出機序をあらためて見直し、それらの発生要因や制御機構とがん細胞特異的放出機序との関連を調べることも重要と考えている。
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| Causes of Carryover |
昨年度購入したリアルタイムPCRや培養用試薬、高価な阻害剤等が残っており、経常の出費が抑えられたことと、遺伝子ノックダウンの実験が一度で結果が出せたことから出費が少なくて済んだことなどから予算額より少なく抑えられた。次年度はもともと予算額が少ないため、当初予定よりも多額の費用が必要と思われる上記の実験遂行にこの繰り越し予算は欠かせない。
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