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2018 Fiscal Year Research-status Report

Calcium dysregulation by channelophay and pahological role in kidney podocyte

Research Project

Project/Area Number 18K06872
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

森 誠之  京都大学, 工学研究科, 准教授 (80342640)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Keywordsチャネロパシー / 巣状分節性糸球体硬化症 / ポドサイト / イオンチャネル / カルシウムシグナル / 電気生理 / 構造機能相関 / 腎疾患
Outline of Annual Research Achievements

腎疾患の一つ, 有性遺伝性の巣状分節性糸球体硬化症(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)において受容体作動性Ca2+チャネル,TRPC6に変異があることが報告されている。然しながらTRPC6変異と病態発症メカニズムの関連には不明な点が多く,詳細な解析が求められている。
本研究ではTRPC6の分子基盤を明確にする為,カルシウム結合タンパク質calmodulinやTRPC6のcoiled-coil領域によるCa2+依存的不活性化(Ca2+-dependent inactivation: CDI)の関与を検討した。 その結果, CDIの発生にはTRPC6とcalmodulinの両房構造による複合体形成と,TRPC6のcoiled-coil領域による近接,集合化が必須である知見を得た。 本構造機能的知見をもとにFSGS型TRPC6を電気生理学的に解析した。 実施した5種類全ての変異体においてCDIの遅延を認めた(HEK293細胞での解析)。 Inside-outの実験からCDIが消失していることを再確認した。 FSGS型TRPC6のcoiled-coil領域の集合体形成について蛍光エネルギー移動により解析したところ,野生型に比べFSGS型は集合体形成に変化が生じていた。 FSGS型TRPCチャネルではcoiled-coilを介した集合体形成異常がCDIの遅延に関連することを見出した。 同様の実験を腎臓糸球体上皮細胞(培養型ポドサイト)で実施した。FSGS型TRPC6チャネルやcalmodulinの変異体を発現させると,持続性Ca2+流入が惹起され,アクチンフィラメントの形成異常が生じることを確認した。
以上,FSGS変異型TRPC6チャネルにおけるCDI機構破綻と機能亢進(Gain-of-Fucntion),ポドサイト細胞障害の関連性を明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

実験計画1の FSGSを示すTRPC6変異体のCDI定量的解析について:電気生理学的解析は予定を超えて順調に進んでいる。
実験計画2のTRPC6,CDIに必要な分子構造基盤の解析について:Coiled-coilドメイン相互作用によるサブユニット間の近接等を見出した。

Strategy for Future Research Activity

定量的解析において、ケージド化合物を用いる手法は定量性には優れているが、コストがかかりすぎるため、代わりにInside-outによる手法を用いることにする。一方で意外なことにFSGS型TRPCチャネルのcoiled-coilは野生型に比べ強弱に富んだ相互作用を示していた。今後FRET等の手法により,構造学的な解析を行う。

Causes of Carryover

ケージドを用いた実験を予定していたが、Inside-outを代用することで実験遂行が可能となった。その結果、計画より順調に出たため、論文の執筆等に時間をかけ、使用計画と相違することとなった。

  • Research Products

    (1 results)

All 2019

All Presentation (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Presentation] Impairment of Ca2+-dependent inactivation of Glomerular disease mutations2019

    • Author(s)
      森誠之
    • Organizer
      FAOPS2019
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2021-03-11  

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