自発的小胞放出を欠損するゼブラフィッシュを用いたシナプス伝達メカニズムの解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06882
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 小野 富三人 大阪医科大学, 医学部, 教授 (70743996)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: シナプス小胞放出 / ゼブラフィッシュ / 神経筋接合部

Outline of Annual Research Achievements

野生型と比較して、我々の注目している突然変異体の神経筋接合部ではシナプス小胞放出が異なっており、突然変異体では自発性のシナプス小胞放出がほぼ欠損している。そのメカニズムを探るというのが研究計画の骨子であった。このため、野生型と突然変異体のゼブラフィッシュ幼生を条件を揃えて育てた上でsacrificeし、それぞれからmRNAを抽出してNext Generation Sequencing によってRNAseqを行なった。専用のソフトウェアを用いて、発現量に差がある遺伝子、すなわち野生型と比べて突然変異体で増加しているもの、減少しているもののうち、変化が閾値以上に大きいものを選び出し、一次的な解析を進める候補遺伝子として同定した。それぞれの遺伝子についてデータベース上で他種での研究論文などの文献検索を行い、自発性のシナプス放出に関わっている可能性のある遺伝子を１０個以内に絞った。digitalPCRを用いて、その遺伝子で、RNAseqで見られたのと同様に確かに発現量が変化していることを確認した。さらに一部についてはIn situ hybridizationを用いて発現の時期および組織特異性を調べた。また特異的なエピトープを選択して抗体を作成し、In situ hybridizationの結果と比較した。シナプスの形態的観察に関しては野生型と突然変異体のゼブラフィッシュ幼生それぞれを電子顕微鏡での観察で条件を検討した。神経筋接合部は観察が可能であるが、統計的な処理に関してはさらなる検討が必要であると思われた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

概ね研究計画どおりに進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までに得られた結果をもとに、候補遺伝子のさらなる解析を進める。形態的解析についても引き続き条件検討を進める。

Causes of Carryover

4116円の次年度使用額が生じたので、次年度に物品費として使用する。