光遺伝学的アプローチによる神経分泌ニューロンへのシナプス入力修飾メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06883
• Research Institution: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• Principal Investigator: 石井 雅宏 産業医科大学, 医学部, 学内講師 (30461560)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上田 陽一 産業医科大学, 医学部, 教授 (10232745)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 光遺伝学 / バゾプレッシン / シナプス入力修飾 / 神経内分泌 / パッチクランプ法

Outline of Annual Research Achievements

AVP-ChR2-eGFP トランスジェニックラット(5-7 週齢) に、2％食塩水負荷を5日間行い、脱水状態にする。その後、麻酔下で迅速に脳出しを行い、SON を含む300 μm の切片を作成した。SONを含む脳スライス標本を用い、蛍光顕微鏡でAVP-ChR2-eGFP陽性ニューロンを同定した。同定したニューロンに対しホールセルパッチクランプ法により膜電位を固定した状態で膜電流は問題なく記録できた。次に記録しながら青色光照射した。青色光が照射された際に細胞内へのinward currentが照射前より増加していることが複数回、異なった切片で確認できた。また、この変化は青色光の照射を中止すると速やかに元に戻った。これにより細胞単離だけでなく、スライスの状態でもAVPニューロン中のChR2が正常に機能していることが確認できた。次に固定膜電位が変化することにより青色光照射中のinward currentも変化することが確認できた。また、固定膜電位を変化とさせることにより膜電流の変化も起こることが観察できた。固定膜電位とinward currentの測定を繰り返し行い、2者は比例関係にあることが確認できた。
次に膜電位を固定した状態で青色光照射前の膜電流を観察し、その後照射し、人為的にAVPニューロン終末からAVPが放出させた後の膜電流を観察実験を行った。照射前(AVP放出前)と照射後(AVP放出後)でEPSCやIPSCの頻度やその電流の大きさに変化を観察した。
変化が生じるケースもあったが、生じない場合もあり、有意差をもった変化は確認できなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

膜電位を固定した状態で青色光照射前の膜電流を観察し、その後照射し、人為的にAVPニューロン終末からAVPが放出させた後の膜電流やEPSCやIPSCの頻度を観察した結果が当初予想した仮説と異なり、研究の進捗が遅れたため。

Strategy for Future Research Activity

膜電位を固定した状態で青色光照射前の膜電流を観察し、その後照射し、人為的にAVPニューロン終末からAVPが放出させた後の膜電流の変化やEPSCやIPSCの頻度変化がはっきりしないため、AVP受容体拮抗薬の投与下での観察ではなく、AVP-CｈR2-eGFP陰性のAVPニューロンで膜電位を固定した状態で青色光照射前後の膜電流観察を行い、AVPによる傍分泌効果。の有無を検討する。

Causes of Carryover

進捗状況が遅く、予定していた実験の試薬や器具の購入まで行かなかったため。令和2年度に研究時間を割き、遅れている分の実験も行う。