2018 Fiscal Year Research-status Report
新規心線維化シグナリング分子の同定と拡張不全治療への応用
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18K06898
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
岩田 和実 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60305571)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 みさき 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80533926)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 心線維化 / 活性酸素種 / NADPHオキシダーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我が国では左室駆出率の保持された心不全 (Heart Failure with Preserved Ejection Fraction: HFpEF) が心不全患者の50%以上を占めるものの、予後を改善する治療法がない現状である。HFpEFの主因は心筋細胞の肥大と線維化による拡張不全であることから、線維化を阻止する新しい薬物の登場が待たれる。本研究の目的は心臓の線維化を惹起する新規シグナリング分子の同定と、HFpEF 治療への応用である。申請者はこれまで活性酸素種 (ROS) 産生酵素であるNADPHオキダーゼの誘導型分子種、NOX1の遺伝子欠損マウス (Nox1-KO) を独自に作製し、、アントラサイクリン系抗腫瘍薬であるドキソルビシン（DOX）投与によって急激に惹起される心臓の線維化がNox1-KOで強く抑制されることを報告した。当該年度には心筋細胞におけるNOX1 が未知のシグナリング分子の産生・分泌を介し、心線維化を亢進させることを見出した。NOX1により調節される心線維化に関わる因子を同定するために、ゲノム編集によりNOX1を欠損させた心筋芽細胞を作製した。NOX1欠損心筋芽細胞の培養上清は野生型細胞の上清と比較して心線維芽細胞の増殖活性が低く、また上清を熱処理することにより両遺伝子群で心線維芽細胞増殖か活性が失活した。このことから心筋のNOX1は細胞の増殖促進因子の産生もしくは分泌を亢進することが明らかとなった。同様に心筋芽細胞のホモジネートを心線維芽細胞に処置したところNOX1欠損心筋芽細胞では心線維芽線維芽細胞の増殖活性が低かったが、熱処理をしたところ非熱処理の野生型細胞のホモジネートと同程度まで増殖の活性が増加した。以上より心筋のNOX1は心線維芽細胞の増殖因子を増加させるのみならず、抑制因子の産生もしくは活性を抑制している可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度には心筋細胞におけるNOX1 が未知のシグナリング分子の産生・分泌を介し、心線維化を亢進させることを見出した。NOX1により調節される心線維化に関わる因子を同定するために、ゲノム編集によりNOX1を欠損させた心筋芽細胞を作製した。NOX1欠損心筋芽細胞の培養上清は野生型細胞の上清と比較して心線維芽細胞の増殖活性が低く、また両遺伝子群で培養上清はDNaseおよびRNaseの処置では影響を受けないが，プロテアーゼおよび熱処理することにより心線維芽細胞の増殖活性が失活した。このことから心筋のNOX1は細胞の増殖促進因子の産生もしくは分泌を亢進することが明らかとなった。同様に心筋芽細胞のホモジネートを心線維芽細胞に処置したところNOX1欠損心筋芽細胞では心線維芽線維芽細胞の増殖活性が低かった．野生型の心筋細胞ホモジネートによる心線維芽細胞の増殖はTLR4の阻害薬により抑制されたことから、内因性のTLR4のリガンドとなるHMGB1, フィブロネクチンおよびS100A1の遺伝子発現を検討したところ、NOX1欠損細胞ではS100A1発現の低下が認められた。またゲノム編集によりS100A1を欠損させた細胞ではホモジネートによる心線維芽細胞の増殖が抑制された。このことから心筋細胞のNOX1はS100A1の発現を調節し心線維芽細胞の増殖を亢進することが明らかとなった。
一方で、NOX1欠損心筋芽細胞のホモジネートを熱処理したところ非熱処理の野生型細胞のホモジネートと同程度まで増殖の活性が増加した。このことから心筋のNOX1は心線維芽細胞の増殖因子を増加させるのみならず、抑制因子の産生もしくは活性を抑制している可能性が示されたため、NOX1により調節されるシグナル分子の同定が予定よりやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
NOX1により調節される心線維芽細胞の増殖抑制シグナリング分子を同定するため、細胞ホモジネートをゲルろ過クロマトグラフィーにより分画する。野生型およびNOX1欠損細胞から得られた分画を用い、心線維芽細胞の増殖抑制作用を比較する。シグナリング分子は ROS により発現量または活性が調節されると考えられるためで差が認められた分画のレドックスプロテオーム解析により含まれるタンパク分子の含有量および酸化還元状態を検討する。野生型と NOX1 欠損細胞で差異を認めた候補分子について、ゲノム編集により候補分子を欠損させた H9c2 細胞を作製する。それぞれの細胞の培養上清を心線維芽細胞に添加し、細胞の増殖抑制が認められる分子を抽出する。
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