ANPの組織繊維化抑制作用の機序解明と肺線維症治療への応用

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06909
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 三浦 浩一 九州大学, 医学研究院, 助教 (20360349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 錦織 充広 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 特任研究員 (00633645) ; 野尻 崇 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (50570553) [Withdrawn] ; 熊添 基文 九州大学, 農学研究院, 学術研究員 (70737212) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 組織繊維化 / Hippo経路 / ANP / 細胞骨格 / PAK4

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続き、ANP受容体を安定に発現させた不死化内皮細胞(SVEC/GC-A)を用いてANPの細胞内シグナル伝達経路の解析を行った。これまでに、(1)組織繊維化の抑制に関与するHippo経路がANPにより活性化されること、(2)セリン/スレオニンキナーゼPAK4がHippo経路の活性化に関与すること、および(3)ANPによりCXCL10等の炎症関連遺伝子の発現が強く抑制されることを明らかにした。しかしながらその後の検討により、PAK4の発現抑制だけでは完全にANP依存的なHippo経路の活性化が抑制されなかったことから、他にも重要な制御因子の存在が示唆された。
そこで本年度は質量分析機を用い、ANP受容体に結合するタンパク質の同定をさらに継続するとともに、ANP刺激によりRXXSモチーフがリン酸化されるタンパク質の同定も行い、ANPとHippo経路をリンクする因子の同定を試みた。
その結果、興味深いことにいずれの解析にも共通して、FilaminA/B/C、Myosin-9/10/14やTalin-1などの細胞骨格制御分子が同定された。このことはANP依存的にこれらの分子がGC-Aと相互作用し、かつRXXSモチーフがリン酸化されることを示す。実際にウェスタンブロットによってANP刺激によるFilaminAのリン酸化およびGC-Aとの相互作用が確認された。
Hippo経路は細胞骨格の再編成とそれに伴う細胞の形態変化により活性が制御されることから、ANPによるHippo経路の活性化にこれらの細胞骨格制御因子が関与する可能性が考えられるため、今後さらに検討を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は質量分析機を用いた解析により、ANP依存的にGC-Aと複合体を形成し、かつRXXSモチーフがリン酸化される分子を複数同定することができた。これらの分子はいずれも細胞の形態制御に関わっており、Hippo経路の制御に関するこれまでの知見と照合すると興味深い結果と考えられる。
このように細胞内シグナル伝達経路の解析は順調に進行中である一方、ANPによるエクソソーム解析を担当予定の研究分担者が所属変更により研究分担者を辞退したことにより、本解析は遂行が不可能となった。
したがって当初の研究計画の一部中止を余儀なくされたため、やや遅れている、と判断した。

Strategy for Future Research Activity

今年度質量分析機を用いて同定された、GC-Aと結合し、かつリン酸化されるタンパク質(FilaminA/B/C、Myosin-9/10/14およびTalin-1)に関し、発現抑制または過剰発現を行い、Hippo経路の活性(Lats1/2とYAPのリン酸化)に与える影響を検討する。すでに得られているマイクロアレイ の結果から、炎症関連の遺伝子の発現が大きく変動することが明らかとなっているので、Hippo経路との関連を検討し、内皮細胞におけるCTGFやCyr61以外のYAP標的遺伝子を同定する。
以上の検討から内皮細胞における炎症制御シグナルとしてのANP/Hippo経路の役割を明らかにしたい。なお前述の理由によりエクソソーム解析は中止する。

Causes of Carryover

本年度は出張予定がオンラインでの会議などへ変更となり、当初の申請と使用予定額が変更となった。