2018 Fiscal Year Research-status Report
マスト細胞遺伝子発現制御におけるGata1/Gata2とPU.1の相互作用の解析
| Project/Area Number |
18K06920
|
|---|
| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
|---|
Principal Investigator |
大根田 絹子 高崎健康福祉大学, 薬学部, 教授 (50323291)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大森 慎也 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (10509194)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | マスト細胞 / 高親和性IgE受容体 / 転写因子 / 遺伝子発現制御 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、マスト細胞特異的遺伝子の発現制御にGATA因子（GATA1とGATA2）とPU.1との相互抑制作用がどのように機能しているのかを明らかにすることである。初年度はまず、マスト細胞における PU.1完全欠失の表現型が報告されていなかったため、エストロゲン誘導性にCre-loxPシステムが作動する「条件付きPU.1ノックアウトマウス」から作製したPU.1欠失骨髄由来マスト細胞（BMMCs）を用いて主な表現型を解析した。その際、既に報告されているsiRNAによるPU.1ノックダウン（KD）マスト細胞との比較と、PU.1欠失時のGATA因子の発現変動に注目した。その結果、PU.1を完全に欠失させたBMMCsは、細胞の生存率、細胞の形態、顆粒の染色性、抗原非依存性の脱顆粒能は、野生型BMMCsと同様であったが、高親和性IgE受容体（FceRI）の発現強度の減少、FceRIb mRNAの発現量低下、シグナル分子Sykの発現低下が認められ、抗原刺激によるマスト細胞の脱顆粒反応が低下していた。これらの表現型は、PU.1KDBMMCsの解析で報告されている表現型と一致していた。また、PU.1欠失時には、GATA1とGATA2のmRNA量が中等度に増加していた。一方、GATA因子をKDしたBMMCsやMEDMC-BRC6マスト細胞株（BRC6細胞）でのPU.1mRNA量は、単一のGATA因子をKDしても変化はなく、GATA1とGATA2の双方をKDすると顕著に増加した。この細胞では、PU.1が過剰に発現しているにも関わらず、FceRIb mRNA量は顕著に低下していた。また、FACS解析でのFceRIの発現は細胞表面のFceRIアルファ鎖に対する抗体で検出しているが、PU.1欠失BMMCsでは、FceRIaのmRNA量は逆に増加しており、FceRIbのmRNA量と相関していた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PU.1欠失BMMCsの解析は、当初の計画どおり進めることができた。得られた表現型は既に報告されているPU.1KDBMMCsの結果とほぼ同様であったが、PU.1欠失時のGATA因子の発現変化を解析し、GATA2欠失BMMCsとの比較解析、GATA1/GATA2/PU.1を種々の組み合わせでKDしたBRC6細胞での発現解析を併せて行ったことで、いくつかの新たな知見が得られた。特に、FceRIb（Ms4a2遺伝子産物）の発現制御に関しては、1）GATA2とPU.1のいずれかを欠失させると同程度にFceRIb mRNA量が減少するが、両者を同時に欠失させても更なる減少は見られないこと、2）GATA1はGATA2によるFceRIb mRNA量の減少を増大させるが、PU.1によるFceRIb mRNA量の減少には影響しないこと、3）GATA1とGATA2を同時にKDしたBRC6細胞では、PU.1 mRNA量は約2倍に増加しているにも関わらず、FceRIb mRNA量は著しく低下していることが明らかになった。これらの結果は、Ms4a2遺伝子の発現制御に関して、GATA因子とPU.1は共に正の制御因子としてはたらくが、PU.1の作用にはGATA因子の存在が必要であることを示唆している。今回の解析から、FceRIbは、機能的に重要なマスト細胞特異的遺伝子であるばかりでなく、そのmRNA量がマウスBMMCsでのFceRIの発現量を規定し、GATA因子とPU.1が共に制御に関わる代表的な遺伝子と考えられた。そこで現在は、GATA因子とPU.1によるMs4a2遺伝子の発現制御機構を明らかにするために、GATA因子とPU.1がMs4a2遺伝子のどのシス領域に結合するのかについて、ChIP-SEQデータベースによる候補領域の検索、BMMCs、BRC6細胞を用いたChIP解析を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
GATA因子とPU.1は血球分化において、細胞系列を決定する主要な転写因子である。両者はお互いの発現を抑制し、異なる遺伝子標的遺伝子のセットを制御することが知られている。さらに、最近のシングルセルレベルのゲノムワイドな解析では、多分化能を有する前駆細胞では、両者が同時に発現している細胞がほとんど存在しないことがわかってきた。一方、マスト細胞には、GATA因子とPU.1が共に発現していることが知られているが、両者が同時に同一の遺伝子の発現制御に関与することがあるのかどうか、十分に解析されていない。マスト細胞においてGATA因子とPU.1がお互いの発現を抑制するのであれば、マスト細胞特異的遺伝子は、GATA因子、PU.1それぞれの標的遺伝子のグループに分けられる可能性も考えられる。しかしながら、本研究のこれまでの解析で、マスト細胞において機能的に重要であるMs4a2遺伝子が、GATA因子とPU.1によって同じ方向（発現促進）に制御され、しかも両者の作用メカニズムが異なっていることを示唆する知見が得られた。今後の研究では、Ms4a2遺伝子の発現制御機構を明らかにするため、主にシスエレメントの解析を進めていきたい。制御に関わるシスエレメントの機能評価は、近年CRISPR-Cas9法によるゲノム編集技術により細胞～個体レベルで解析可能となった。本研究でもGATA因子やPU.1の結合領域を欠失させて、Ms4a2遺伝子発現への影響を解析していきたい。また、ノックアウトマウス由来BMMCsのゲノムワイドな発現解析を組み合わせることによって、GATA因子とPU.1が共に制御に関わっているマスト細胞特異的遺伝子の数や機能の特徴を明らかにしていきたい。
|
