2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K06927
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
後藤 英仁 三重大学, 医学系研究科, 教授 (20393126)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | チェックポイントキナーゼ１ / 細胞生存 / 細胞周期 / チェックポイント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チェックポイントキナーゼ１（Chk1）は、DNA損傷時や複製障害時にATRの下流で活性化するトランスデューサー分子である。このようなDNA損傷応答時には、Chk1はCdc25Aをリン酸化することが知られている。このCdc25Aのリン酸化修飾を契機にCdc25Aはポリユビキチン化され、最終的には、20Sプロテアソームで分解される。Cdc25Aはサイクリン依存性キナーゼの活性化に必須の分子であるため、Chk1によるCdc25Aの分解誘導は最終的には細胞周期の停止を導く（細胞周期
チェックポイント）。この間に、損傷DNAは修復される。
他方、Chk1は、（外的DNA損傷刺激のない）正常な細胞周期進行にも深く関わっており、この際のChk1機能が障害されると細胞は死に至る。しかし、その詳細な分子機構は不明である。
研究代表者らは、これまでに、内在性Chk1タンパク質にauxin依存性分解デグロン（mAID）と標識タグを付加した細胞株の樹立に成功した。この細胞にauxinを反応させると、内在性Chk1を特異的かつ即効性に分解できる。昨年度、この細胞株を用いて、主に、Chk1の特異的かつ急速な分解後に引き起こされる反応を解析し、基本的には、DNA障害チェックポイントの際と同様な下流シグナル経路を介して、（外的DNA損傷のない）通常の細胞周期進行（細胞の生存）の際にもChk1が機能していることを解明した。本年度、通常の細胞周期進行において、Chk1の機能阻害により細胞周期のどの時期で停止するのか、それとも、細胞周期に関係なくアポトーシスを引き起こしてしまうのかについて解析を行った。その結果、外的DNA損傷のない状態でのChk1の機能阻害は、S期またはG2期で細胞周期を停止すること、その停止が長引くとアポトーシスが引き起こされることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに、Chk1とCdc25Aの内在性タンパク質にauxin依存性分解デグロン（mAID）と標識タグを付加した細胞株を樹立するなどすることで、外的DNA損傷のない状態においても、Chk1がCdc25Aをリン酸化し分解することで円滑に細胞周期を進行していることを明らかにした。本年度、FACSに細胞周期解析などを精力的に行うことで、外的DNA損傷のない状態でのChk1の機能阻害により、細胞がS期またはG2期で停止することを明らかにした。また、Chk1を長く機能阻害する（細胞周期停止を長時間持続させる）と、その中の細胞の一部がアポトーシスを引き起こすことも判明した。これまでの他のグループの解析および我々が明らかにした事象から、Chk1が通常のS期におけるDNA複製に深く関与していることが明らかになった。言い換えると、DNA複製開始点において、Chk1が複製開始を負に制御することで、DNA複製が秩序だって引き起こされることを強く示唆するものといえる。また、同時に、このChk1機能は細胞の生存に不可欠であることを示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者らのグループは、Chk1がDNA損傷チェックポイントと通常の細胞周期進行で標的基質を基本的には変えていないことを明らかにした。そのため、当初の目的である、通常の細胞周期進行に特異的な新規基質の探索は困難になったと言わざるをえない。しかし、研究代表者らが確立した、内在性Chk1を特異的かつ即効性に分解できる細胞株を用いれば、Chk1機能阻害後すぐに低下するタンパク質のリン酸化修飾を網羅的に解析できる。つまり、この細胞株を用いれば、何らかの新規のChk1基質を同定することができる可能性がある。本年度は、この目的に向かって、研究を推進する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初の計画では、DNA損傷応答時と（外的DNA損傷刺激のない）通常の細胞周期進行において、下流の基質が異なる可能性を想定していた。しかし、得られた結果はこの想定とは逆に大きな変化はないことが判明した。そのため、（外的DNA損傷刺激のない）通常の細胞周期進行に特異的な基質を同定するという当初の目的は困難になったといえる。この結果を受け、Chk1の新規の基質を探索するという方向に研究を進めることに計画を変更した。しかし、これまでに測定条件の準備等がまだ整っていないため、当初、外注で想定した基質の網羅解析のための質量分析をまだ行えていない。そのため、当初の予定していた（Chk1の新規基質探索のための）質量分析解析を最終年度に行うことに変更した。
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