2018 Fiscal Year Research-status Report
蛍光タンパク質ノックインによる上皮メカノセンサーの分子数計測
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18K06932
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
栗栖 修作 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (40525531)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | メカノセンシング / 上皮細胞 / アクチン細胞骨格 / Vinculin / E-cadherin / 細胞間接着 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮細胞の機械刺激への応答性（メカノセンシング）の分子メカニズムを解明するためには、そこで働く分子の量的動態を知ることが一つの有力な方法となる。しかし、内在性のタンパク質の「量」を知る手段は現在のところ確立されていない。本研究ではゲノム編集技術を用いて内在性のタンパク質に蛍光タンパク質タグを付加し、その蛍光強度を比較することで種々のタンパク質の相対量を決定することを当面の目標とした。さらにその技術を用いて量的側面から上皮メカノセンシングの新たな動作原理を解明することを目指している。
2018年度の計画はメカノセンシングに関わる種々の遺伝子のC末端側に緑色蛍光タンパク質（GFP）、あるいは赤色蛍光タンパク質（RFP）をホモ接合でノックインした上皮細胞株を樹立することであった。本年度の成果としては、細胞間接着を構成し、メカノセンシングの分子基盤となるカドヘリン複合体の遺伝子であるCdh1とCtnna1（タンパク質名はそれぞれE-cadherin, alpha-Catenin）、それらの遺伝子とアクチン細胞骨格を繋ぐVclやActn1/4（Vinculin, alpha-Actinin-1/4）、またタイトジャンクションを構成するTjp1/2（ZO-1/2）についてGFPノックイン細胞株の樹立に成功した。いくつかの遺伝子についてはRFPノックイン株も既に樹立している。成功した遺伝子の数は多くはないものの、現段階で得られた七種類の遺伝子に対するノックイン株を用いてタンパク質量を比較することができる。そこから得られる量の情報は全く新規の知見であり、上皮メカノセンシングの分子メカニズムの解明に資する重要な成果であると期待している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
次年度以降の目標であったタンパク質存在量の決定についても既に着手している。まず細胞間接着の形成初期段階で形態的にも観察しやすいPunctate Adherens Junction (pAJ)に着目した。pAJでは細胞間接着複合体にアクチン細胞骨格を介した牽引力がかかっていると考えらておりメカノセンシングが働く代表的な細胞器官である。ノックインに成功した遺伝子群に対する解析ではpAJに存在するタンパク質の相対量比を決定することができた。この量比については後述の誤差を含み、値の正確性について詳細に検討を加える必要がある。しかし例えばZO-2はVinculinと同等の存在量があることが示唆されるなど、従来では全く知られていなかった量の情報が本研究によって明らかになりつつあることは大変意義深いと考えている。現段階ではGFPのみを用いて定量を行なっているが、RFPでも同様の解析を行うことで定量の正確性を担保することができると期待され、これについては進行中である。また、上述の解析は現在のところホルムアルデヒドによる固定を行なった細胞について行っている。固定に伴う誤差を生じる要素として、例えばタンパク質が正しい局在で保持されているか、や、固定によるGFPの蛍光効率の変化などが挙げられる。それらを含むいくつかの誤差要素については定量に与える影響を見積もることが課題として残っており、一つずつ解決していく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回ノックインを試みたものの成功しなかった遺伝子としてはCtnnb1, Zyx, Lima1（beta-Catenin, Zyxin, EPLIN）があった。原因はいくつか考えられるが個々の遺伝子座によってノックイン効率が大きく変わること、C末端にタグを付加することでタンパク質が不安定化する場合があること、タンパク発現量が低く細胞クローニングの際に見落としていることなどが挙げられる。三つめの理由の場合は高感度・ハイスループットの顕微鏡を使うなど、技術的に改善可能であるため次年度も継続してノックイン株の種類を増やしていく予定である。
メカノセンシングに関与するタンパク質の定量解析については、次年度以降は生細胞を用いてタンパク量の時間変化を追跡することを予定している。そのためにはライブイメージング中に生じるシステム的、あるいは人為的な蛍光誤差をできるだけ小さくするよう測定条件を最適化し、さらに誤差自体を見積もる必要もあるだろう。ライブイメージングでは免疫染色法が使用できないため観察領域の設定に工夫をする必要がある。固定細胞ではE-カドヘリンの免疫染色像によりpAJを検出し測定領域としたが、生細胞ではE-カドヘリンやbeta-Cateninなどに蛍光タグを付けて生きたまま接着領域を可視化することを考えている。そのための遺伝子導入法や測定条件の設定など検討すべきことはあるが、なるべく早急に生細胞での定量ができるよう注力する。
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| Causes of Carryover |
３月に155,410円分の研究試薬等の物品を購入しており、それが４月支払いとなっているため残額が生じた。
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Research Products
(1 results)
