Studies on mitochondrial long noncoding RNA

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06935
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 本間 好 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (60192324)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 非コードＲＮＡ / ミトコンドリア / 脂質代謝 / 呼吸系 / マイクロＲＮＡ

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリア内には多様な非コードRNA (ncRNA) が存在する。これまでに、長鎖非コードRNA (lncRNA) やマイクロRNA (miRNA)が報告されているが、それらの機能については未だに明らかにされておらず不明な点が多い。本研究では、正常および代謝性疾患モデルマウスの肝細胞ミトコンドリアに存在するncRNAをRNA-seq法にて網羅的に解析し結果をデータベスとして登録することを目指す。さらに代謝性疾患で発現量が著しく変化するncRNA候補を選定し、相互作用分子の解析、および過剰発現やsiRNAを用いたノックダウン等の方法によってそれらの機能を明らかにすることを目的とする。今回、モデルマウスとして正常C57BL/6のほかに、肥満モデルとしてC57BL/6-ob-/ob-、糖尿病モデルとしてC57BL/6-db-/db-、非アルコール性脂肪肝（NASH）モデルとしてC57BL/6-NASHを用いた。各モデル肝ミトコンドリア画分に含まれるncRNAのRNA-seq解析がほぼ終了し、それぞれのモデルで１万種以上のncRNAが発現していることが明らかになった。現在、それぞれの発現量の比較解析を進めている。次に、特にNASHモデルに注目し、発現量が異なるncRNAを数個選定した。それらの機能を明らかにする目的で、各々について発現用レンチウイルスベクターを作製した。現在、ES細胞およびマウス3T3-L1細胞の脂肪細胞分化モデルを用いて、ncRNAクローン発現の脂肪細胞分化や脂肪合成に与える効果を観察している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究は概ね順調に進行しているが、いくつか問題が発生したため研究計画を一部変更した。当初、遺伝的バックグランドが同じ４種のモデルマウスの入手を試みたが、C57BL/6-ob-/ob-およびC57BL/6-db-/db-については入手できないことが判明したため、主たる比較解析を正常C57BL/6とC57BL/6-NASHとの間で行うこととし、ob-/ob-およびdb-/db-のデータをリファレンスとすることとした。次に、lncRNAの発現が確認できない問題が生じた。既報に従い発現用レンチウイルスベクターを作製したが、いずれのクローンにおいても発現細胞中に目的のlncRNAトランスクリプトが検出できなかった。その原因は特定できていない。そこで、lncRNAについては過剰発現系により各クローンの機能を明らかにすることを断念し、siRNA法等を用いたノックダウン解析に切り替えることとした。

Strategy for Future Research Activity

正常および３種の代謝疾患モデルマウスの肝ミトコンドリア画分に含まれるncRNAをデータベース化し登録準備する。正常C57BL/6とC57BL/6-NASHとで比較し、発現量がNASH特異的に顕著に増減するlncRNAおよびmiRNAクローンを選定する。特にNASHで特異的に高発現しているクローンに注目し、siRNAなどを用いたノックダウン法や、miRNAについては過剰発現系を用いて細胞増殖、細胞死、ATP産生およびROS産生、脂肪細胞の分化プロセスや脂肪代謝系に及ぼす影響を解析する。同時に、正常およびC57BL/6-NASHのミトコンドリア機能複合体の解析をすすめる。免疫沈降法などにより、各呼吸鎖複合体、β酸化複合体などの精製標品を調製し、複合体の分子性状を解析し、さらに、複合体に含まれるlncRNAやmiRNAを検出し同定する。同定されたncRNAについて、過剰発現系やsiRNAを用いた解析などから複合体構成や機能発現における役割を評価する。

Causes of Carryover

少額のため物品購入ができなかった。次年度の物品費に充てる。