2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of inhibitory mechanism of binding of long noncoding RNA via arginine methylation and its physiological significance
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18K06939
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
黒川 理樹 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70170107)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アルギニンメチル化 / RNA結合たんぱく質 / TLS / FUS / lncRNA / pncRNA-D |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、RNA結合タンパク質(RBP)・TLSがヒストンアセチル化酵素(HAT)を阻害することを示した。TLSのHAT阻害には長鎖非コードRNA(lncRNA)であるpncRNA-Dの結合が必須であった。本lncRNAはRBPに結合して生理的に機能していた。最近、TLSのアルギニン(R)メチル化がpncRNA-D結合を抑制する結果を得て、Rメチル化がTLSのHAT阻害を抑制する仮説を着想した。本研究の目的は、この仮説の検証である。TLSはヒトHeLa細胞の2万種以上のRNAと結合するが、この結合はRメチル化により減少した。従って、Rメチル化は、TLSのlncRNA結合、すなわち、RNA結合タンパク質を介したlncRNA機能を抑制すると予測された。
当該年度は、RNA結合に関与するアルギニン残基(R)を同定し、次にメチル化でpncRNA-D結合を抑制するRを決めた。予備実験から、TLSのC末端側(TLS-4)のRがRNA結合に関与していた。TLS-4には、R394からR498まで、9個のRが存在する。この中で、どのRがメチル化特異的にRNA結合を抑制するか特定した。すでに、候補の残基(R476・481)が見出されていた。部位特異的な突然変異法を用いてRをアラニンに変換して、抑制性のRを特定した。メチル化されるとpncRNA-D結合が抑制されるRの決定には、上記で同定したR付近のペプチドを用いた実験を行った。TLS(aa470-505)付近で、メチル化および非メチル化Rを持つペプチドを合成しビオチン化pncRNA-Dとの結合を検出した。ペプチドをSDS-PAGEとCBB染色で検出する方法でメチル化依存的にpncRNA-D結合を抑制するRを同定すると、R781 と判明した。この成果は、本研究の分子的基盤を提供する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験計画が予定されたように進行した。したがって、おおむね順調に進展していると判断された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、TLSアルギニンメチル化によるHAT阻害活性に対する効果の検証を実施する。
TLSのHAT阻害活性にはpncRNA-Dの結合が必須である。従って、アルギニン(R)メチル化によりpncRNA-DのTLSへの結合が抑制されると、TLSのHAT阻害活性は消失するはずである。このことを検証する。この結果は、TLSのRメチル化がその機能を制御するという画期的な成果となる。大腸菌発現系で調製したGST-TLSは、まったくRメチル化されておらず、これにpncRNA-Dは結合する。そして、pncRNA-Dと結合したGST-TLSはCBP-HATを強力に阻害する。すでに、PRMT1でGST-TLSをRメチル化するとpncRNA-D結合が抑制され、HAT阻害が減弱する予備的結果を得ている。このことを検証する予定である。
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| Causes of Carryover |
実際の実験が効率的に進んだこと、また、経費節減に努めたことが奏功して、次年度の使用額が生じてきた。これは、上述の【今後の研究の推進方策】の実験等に使用する予定である。
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