コレクチン複合体CL-LKが3MC症候群の病態に与える影響とその分子基盤の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06947
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 松田 泰幸 旭川医科大学, 医学部, 助教 (10532252)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: コレクチン / 3MC症候群 / 発生 / 自然免疫

Outline of Annual Research Achievements

CL-K1は、カルシウム要求性のレクチンであり、これまで自然免疫に関与することが報告されてきたが、ヒトの形態形成に異常をきたす遺伝病（3MC症候群）の患者からコレクチンCL-K1の遺伝的変異が報告されたことにより、CL-K1が自然免疫のみならず、個体発生や成長発育に関わる可能性が示唆されている。また、CL-K1が別のコレクチンCL-L1とヘテロ複合体を形成していることを明らかにしたが、詳細な分子機構は未だ不明である。本研究では、CL-K1およびCL-L1の新規機能を明らかにすることで、3MC症候群の発症原因や発症機序を明らかにするとともに、本疾患の治療法開発に向けた知見の集積を目指す。
令和元年度は、前年度に作製したCL-L1およびCL-K1発現コンストラクトから組換えバキュロウイルスを得た。このバキュロウイルスを昆虫細胞（Sf9細胞）に感染させタンパク質発現を行った。ウェスタンブロットを用いて、感染後Sf9細胞培養上清のCL-L1およびCL-K1の検出を試みたところ、どちらも培養上清中に発現していることが確認できた。この培養上清から、CL-L1、CL-K1に付加されているタグを利用して、タンパク質の精製を行ったところ、ウェスタンブロットで溶出画分からCL-K1およびCL-L1を検出することができたが、CBB染色でバンドを確認できる程の収量ではなかった。次に、CL-L1とCL-K1の２つを１つの感染細胞内で発現できる組換えバキュロウイルスを作製し、同様にウェスタンブロットで発現を確認したところ、CL-L1、CL-K1ともに感染後のSf9細胞培養上清から検出することができた。しかし、CL-L1あるいはCL-K1を単独で発現させた培養上清に比べて、ウェスタンブロットによるCL-L1、CL-K1検出シグナルがかなり弱く、共発現時の発現量が単独発現に比べて少ないと考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

バキュロウイルスを用いてCL-K1、CL-L1を発現および検出することができたが、想定していたよりも発現量が少なく、また、ヘテロ複合体CL-LKの形成を確認できるまでには至らなかった。また、CL-K1およびCL-L1の共発現時においてはさらなる発現量低下が予想され、精製タンパク質を利用した未知の相互作用分子の探索実験を開始するには至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

最適な発現条件を検討する、あるいは他の発現システムに切り替えるなどして、CL-L1、CL-K1の精製を急ぐとともに、既知のリガンド結合活性を保持しているか、生体内と同様にヘテロ複合体CL-LKを形成しているか、等の生物活性保持の検証を行う。活性や構造に問題がなさそうであれば、相互作用分子の探索実験に利用し、CL-K1やCL-L1と相互作用する未知分子の同定を目指す。

Causes of Carryover

未知の相互作用分子の探索実験に必要な精製タンパク質を確保することができなかった。その結果、当初予定していた探索実験を開始するには至らず、試薬の購入費が想定していたよりも少なくなった。次年度以降のタンパク質発現・精製や精製タンパク質の生物活性保持の検証、相互作用解析等にかかる費用に使用させていただきます。