コレクチン複合体CL-LKが3MC症候群の病態に与える影響とその分子基盤の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06947
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 松田 泰幸 旭川医科大学, 医学部, 助教 (10532252)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: コレクチン / 3MC症候群 / 発生 / 自然免疫

Outline of Annual Research Achievements

ヒトの形態形成に異常をきたす遺伝病（3MC症候群）において、CL-L1とCL-K1の遺伝的変異が報告されている。また、CL-K1とCL-L1は生体内においてヘテロ複合体CL-LKを形成していることが明らかとなったことから、CL-LKの分子異常が3MC症候群の発症に関与していると想定される。本研究では、CL-LKの機能を明らかにすることで、3MC症候群の発症原因や発症機序を明らかにすることを目標としている。
本年度は、CL-L1およびCL-K1を発現する組換えバキュロウイルスを用いてCL-L1、CL-K1の発現、精製を行った。前年度に得られた結果をもとに、CL-L1、CL-K1精製画分を得ることに成功はしたものの、非常に微量であり、収量改善のための条件検討を試みたが劇的な改善には至らなかった。次に、CL-K1とCL-L1は生体内においてヘテロ複合体CL-LKを形成していることから、この精製画分のSandwich ELISAを行った。その結果、組換えバキュロウイルス発現系においてもヘテロ複合体CL-LKを形成していることが明らかとなった。CL-L1、CL-K1は分子内にコラーゲン領域を持ち、多量体を形成している。そこで次に、この精製画分の非還元条件下でのウェスタンブロットを行ったところ、生体由来のCL-LKと同様に多量体を形成していることが明らかとなった。以上のように、バキュロウイルス発現系由来のCL-LK精製画分は生体内のCL-LKと類似したタンパク質構造を形成していると考えられた。また、3MC症候群で報告されているCL-L1変異およびCL-K1変異を導入したCL-LK変異体において、野生型CL-LKと同様にヘテロ複合体を形成するかどうかを検証するため、組換えバキュロウイルスを作製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

バキュロウイルスを用いて微量ではあるがCL-LK精製画分を得ることに成功した。また、この精製画分では、生体由来のCL-LKと同様に、CL-L1とCL-K1がヘテロ複合体を形成し、多量体を形成していることを確認できた。さらに、3MC症候群で報告されているCL-L1変異およびCL-K1変異を導入した組換えバキュロウイルスを作製しており、野生型CL-LKと変異型CL-LKの構造的な差異を検証する段階に差し掛かっており本年度としては概ね進捗があった。しかし、研究期間全体としては、当初想定していた予定よりも遅れが生じており、そのため進捗状況の区分を“やや遅れている”とした。

Strategy for Future Research Activity

3MC症候群で報告されているCL-L1変異およびCL-K1変異を導入したCL-LK変異体の発現・精製を行い、野生型CL-LKとの構造的な差異や生物活性の差異を検証する予定である。

Causes of Carryover

結果としてCL-LK精製画分を得ることに成功はしたものの、本年度の前半はその条件検討にやや時間を要した。これにより、試薬の購入費が想定していたよりも少なくなった。次年度の変異型CL-LKの発現・精製や野生型CL-LKとの構造的な差異、生物活性の差異の検討等にかかる費用に使用させていただきます。