2018 Fiscal Year Research-status Report
一酸化窒素(NO)合成酵素由来と外因性NOによるスーパーオキシドの毒性軽減の証明
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18K06948
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
藤井 順逸 山形大学, 大学院医学系研究科, 教授 (00222258)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / スーパーオキシド / ペルオキシ亜硝酸イオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症細胞に誘導的に発現される一酸化窒素合成酵素(NOS2)の産生するNOは、生体の保護に働く一方で、大量に生成した場合には周辺組織を障害する。その際に、NOとスーパーオキシドとが反応して、酸化力の高いペルオキシ亜硝酸イオンが生成し、有害作用を発揮すると考えられている。一方でこの反応は、ラジカル反応を開始させるスーパーオキシドをNOが除去することで有利に働く側面をもつが、生体内におけるこうした分子間相互作用の評価は難しく十分に理解されていない。本研究では、スーパーオキシドの消去を担う主要な酵素であるスーパーオキシドディスムターゼ1(SOD1)とNOS2のノックアウトマウスを用いて、NOによるスーパーオキシド消去の重要性について検証することを目的とした。
SOD1 とNOS2の遺伝子欠損マウスの交配によりSOD1;NOS2二重欠損マウスを作製し、野生型(WT)マウスとそれぞれの単独ノックアウトマウスを加えた4系統のマウスを用いて炎症性刺激による検討を行ない、活性分子種の相互作用について推察する。外傷や手術時の細菌感染によって起こる敗血症では、細菌内毒素が原因となって炎症細胞が活性化され、活性酸素種が大量に生成する。まず盲腸結紮穿刺による敗血症病態モデルを作製し、病態を解析することで遺伝子欠損の影響を調べた。またマウスから腹腔マクロファージを単離し、細胞の解析によりNOとスーパーオキシドの作用について推察した。さらに酸化型システイン（シスチン）の輸送体であるxCTを欠損するマウスのマクロファージを用いて、NOの産生ならびに酸化ストレスに対する応答についても調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
３ヶ月齢の雌のNOS2遺伝子欠損マウスを用いて、盲腸結紮穿刺による敗血症病態モデルを作製したところ、野生型マウスに比べて重篤な症状を示し早期の死亡が認められた。SOD1との二重欠損マウスではむしろ死亡率が低下したので、その原因を解明するために臓器障害について検討を行なっている。SOD1欠損マウスから腹腔マクロファージを単離して比較検討を行なったところ、NOドナーを添加することで生存が改善され、NOによるスーパーオキシドの毒性の軽減が示唆された。
xCT欠損マウス由来のマクロファージではNOやグルタチオンの生成が低下し、酸化ストレスの亢進が認められた。xCT欠損線維芽細胞は通常の培養条件下ではフェロトーシスにより死滅するが、マクロファージは生存していることから、その原因を究明することが細胞の生存機構の理解に繋がると考え、プロテオミクス解析を行なった。その結果、候補となるジペプチダーゼを検出し、その機能解明を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
盲腸結紮穿刺による敗血症病態モデルでは、NOS2遺伝子欠損マウスの病態悪化の原因として、マクロファージによる活性酸素の消去能の低下が考えられる。一方で、SOD1欠損によって増加した活性酸素種が、インターロイキン-1 (IL-1)変換酵素を酸化傷害する結果、炎症性サイトカインであるIL-1の上昇が抑えられることが報告されている(Nat Immunol, 2008)。二重欠損マウスで死亡率が低下した理由として、SOD1欠損により同様の機構でIL-1の上昇が抑制され、炎症反応そのものが軽減している可能性がある。IL-1量の測定ならびにIL-1変換酵素活性を測定してその可能性の検証を行なう。
xCT欠損マクロファージの生存を可能としていると考えられるジペプチダーゼについては、ゲノム編集によりノックアウト細胞を樹立し、その機能を検証する。さらに遺伝子欠損マウスを作製して、マウス個体における機能解明を進める。
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