2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K06953
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
倉田 盛人 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40451926)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 癌遺伝子 / NRAS / CRISPR screening / CRISPR library / CRISPR activation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RASは多くの癌細胞において増殖に関与する癌遺伝子と広く知られているが、既存の報告からシグナルの複雑さや多様性が報告されており、全貌が明らかにされていると言い難い。これまでに、THP-1細胞株に対して、部位特異的に遺伝子編集可能なCRISPR/Cas9 により、内因性のNRASをノックアウトし、同時に外部からDoxycycline発現誘導ベクターを使用して、変異型NRASの発現を調整できる細胞株を樹立した。
昨年よりCRISPR library screeningを使用しKnockout library、Activation libraryによりNRASシグナル非依存的に増殖できる細胞をさらに樹立し、Knockout libraryのスクリーニングから28個、Activation libraryから21個の候補遺伝子が同定した。確認実験として、候補遺伝子のガイドRNAをNRAS発現調整可能細胞に導入した後、Doxycyclineを取り除き、NRASのシグナル非存在下で細胞増殖能を評価し、細胞増殖能を保つ候補遺伝子が同定された。
また、CRISPR activation libraryにおいて、1細胞あたりに導入するガイドRNAウイルスコピー数の調整が可能となった。このことにより、 Activation libraryを使用したスクリーニングでは、次世代シークエンサーを用いて、細胞の増殖に必要な候補遺伝子の同定が可能となった。これまでに、次世代シークエンサー解析の結果から、細胞増殖に必要な因子として、最低リード数を100とした場合8543個の候補配列が得られている。これまでに、データベースと合わせて検証することで、NRASに関連する候補遺伝子の同定を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NRASシグナルに関連する新規分子を網羅的に同定するためにCRISPR knockout library、CRISPR activation libraryを使用している。
昨年よりNRASシグナル非依存的クローンを樹立した。それらのクローンより同定された候補遺伝子を細胞増殖能を評価するMTSアッセイした。CRISPR knockout libraryより同定された28個の候補遺伝子から1個、CRISPR activation libraryの21個の候補遺伝子から1個、NRAS非存在下において増殖能を回復さる候補遺伝子が同定された。また、それらの遺伝子は、knockout library由来の遺伝子ではNRASシグナルにより抑制されており、activation libraryでは、発現が誘導されることが定量的PCRにより確認された。NRASの増殖・生存シグナルに影響していると思われる。
また、次世代シークエンサーの解析結果より、8543個の候補遺伝子が得られている。データベースを用いた解析にて絞り込みが行われており、概ね順調に実験が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
NRASシグナルに関連する新規分子を網羅的に同定するためにCRISPR knockout library、CRISPR activation libraryを使用しているが、knockout libraryは一細胞あたりのCRISPRの感染数を調整することが難しく、CRISPR activation libraryでのみ調整が可能となった。このことにより、 activation libraryを使用したスクリーニングでは、次世代シークエンサーで細胞の増殖に必要な候補遺伝子の同定が可能となった。これまでに、次世代シークエンサーの解析結果から、細胞増殖に必要な因子として、最低リード数を100とした場合8543個の候補遺伝子が得られた。今後、データーベースを用いた解析などを加えて、さらなる絞り込みと確認実験を行う予定である。
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[Presentation] Discovery of cancer genes and pathways operative in PI3K activated mammary cancer2019
Author(s)
Morito Kurata, Kouhei Yamamoto, Masanobu kitagawa, Jingmin Shu, Emily A. Pope, Wenlin Yuan, Wendy A. Hudson, Aaron L. Sarver, Nuri A. Temiz, Mark Sokolowski, Zora Modrusan, Eric Stawski, Stephen Durinck, Sekar Seshigiri, David A. Largaespada
Organizer
第78回日本癌学会総会 大阪
