2019 Fiscal Year Research-status Report
RSKキナーゼ群の機能差を生み出す分子基盤の解明と阻害剤による乳がん抑制への応用
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18K06958
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
福田 信治 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70398238)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 尚代 (西田尚代) 関西医科大学, 医学部, 助教 (00802703)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 乳腺細胞 / シグナル伝達 / Ribosomal S6 Kinase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞外からの情報はリン酸化酵素群(キナーゼ)によるシグナル伝達経路によって核へ伝えられ、細胞増殖や運動など多岐に渡る生命現象を制御することが広く知られている。しかし、個々のキナーゼメンバーが特異的に持つ役割には不明な点が多い。本研究は、乳がんや前立腺がんで高発現を示すp90 Ribosomal S6 Kinase (RSK)ファミリーに着目し、申請者がこれまで研究を行なってきたRSK2を中心に、RSK1など他のメンバーとの違いを解明する。得られる成果は、現在進められている抗がん剤候補化合物であるRSK阻害剤の特異性を評価する上でも重要である。
本研究において、まずは解析の中心となるRSK2の制御に関わる分子を同定する必要がある。本年度はRSK2と相互作用する分子を同定する目的で、改変型近傍標識酵素TurboIDを使用した。まずRSK2のC末にTurboID結合させたコンストラクトを構築し、レンチウイルス ベクターを用いて、乳腺上皮細胞MCF10Aに発現させた。Western blot法によりRSK2-TurboID融合タンパク質の発現を確認し、さらに、培地にビオチンを添加することにより、確かにビオチン化反応が起きていることを確認した。一方で、予想以上に広範囲の分子量にバンドが検出され、これはTurboIDによる非特異的なビオチン化が影響している可能性が考えられた。現在、ビオチン化反応の時間およびビオチン濃度の再検討を行っている。今後はストレプトアビジン付加磁気ビーズを用いて、RSK2複合体構成分子の同定へと進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Western blot法によってビオチン化タンパク質を検出したところ、特異的というよりは広範の分子量にバンドが認められたため、質量分析に進める前に、さらなる条件検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ビオチン化の条件検討を進めたのち、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン付加磁気ビーズを用いて回収する。その後、質量分析により、RSK2複合体構成分子の同定へと進める予定である。
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| Causes of Carryover |
RSK2相互作用因子をビオチン化効率の最適化が遅れており、以降のステップの費用が次年度使用となった。
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