2019 Fiscal Year Research-status Report
Molecular pathogenesis of ICF syndrome
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18K06961
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
鵜木 元香 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (30525374)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ICF症候群 / CDCA7 / HELLS / DNA修復 / DNAメチル化 / Rループ / DNA損傷 / 染色体安定性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ICF症候群は免疫不全、動原体とその近傍領域の不安定化、顔貌異常を主徴とする常染色体潜性遺伝病であり、患者の白血球細胞では、染色体動原体近傍のヘテロクロマチン領域が伸長して融合した異常な染色体が現れる。この症候群の原因遺伝子としてこれまでにDNMT3BとZBTB24が報告されていたが、私達はCDCA7とHELLSを新たな原因遺伝子として同定した（Thijssen et al., Nat Commun, 2015）。CDCA7とHELLSが細胞内で果たす役割を明らかにするため、CDCA7の相互作用蛋白質の網羅的探索をおこない、CDCA7はHELLSや非相同末端結合（NHEJ）型DNA修復に必要不可欠なKu80及びDNA-PKと相互作用する事を見出した。CDCA7やHELLS欠損HEK293細胞は、DNA損傷の異常蓄積、染色体分配異常、アポトーシス細胞の増加などの表現型を呈し、その他の原因遺伝子であるDNMT3BおよびZBTB24欠損細胞もほぼ同じ表現型を呈した。CDCA7やHELLSをノックダウンするとNHEJ活性が低下する事、CDCA7やHELLS欠損細胞ではKu80のDNA損傷部位への集積が顕著に減弱した事から、CDCA7やHELLSはKu80のDNA損傷部位への集積を促進する事で、NHEJ型DNA修復に関与していると考えられた（Unoki et al., J Clin Invest, 2019）。現在、CDCA7やHELLS欠損細胞株では染色体動原体近傍のヘテロクロマチン領域のDNA低メチル化に伴い、通常は起こらない転写がこの領域で起き、Rループ形成を引き起こしていることを見出し、これが領域特異的なDNA損傷の原因となっている可能性を考え、研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請研究の課題は、CDCA7とHELLSがDNA修復および維持DNAメチル化に果たす役割の解明であるが、どちらもかなり理解が進んだ。具体的には、NHEJ活性を検出するためのレポーターをゲノムに組み込んだHEK293細胞を用いて、CDCA7およびHELLSがNHEJに関与することを見出し、またGFP-Ku80恒常発現HEK293細胞を用いて、CDCA7とHELLSがKu80のDNA損傷部位への集積を促進する事を見出した（Unoki et al., J Clin Invest, 2019）。その後、GFP-CDCA7及びGFP-HELLS恒常発現HEK293細胞を用いて、CDCA7やHELLSはDNA損傷部位に集積するのではなく、ローカルなCDCA7やHELLSがDNA損傷部位のクロマチンリモデリングを行い、Ku80の損傷部位へのアクセスを助ける事を示唆するデータを得ている。ICF患者細胞では、反復配列から構成される動原体とその近傍のヘテロクロマチン領域に異常が現れるが、上述した結果はCDCA7やHELLSの領域特異的な集積によるのではなく、この領域にDNA損傷が頻発する事に起因すると考えられる。iPOND-MS/MS解析の結果、CDCA7は維持メチル化酵素複合体の新規合成DNA鎖上への集積を促進すると共に、DNA:RNAハイブリッドと１本鎖RNAから構成されるRループの解消に関与するRNAヘリカーゼDDX21やヒストンシャペロンFACTの集積も促進することがわかった。またCDCA7やHELLS欠損HEK293細胞では、この反復配列からの異常な転写が起こっており、Rループが蓄積していて、Rループを解消するRNaseH1の発現でDNA損傷が減少することなどを見出している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、上述したiPOND-MS/MS解析の結果の再現性の確認実験を進めている。またCDCA7やHELLS欠損細胞でRループが蓄積している領域の特定を、変異型RNaseH1 D210Nを用いたR-ChIPや、DNA:RNAハイブリッドを認識するS9.6抗体を用いたDRIPと呼ばれる方法で進めている。CDCA7とDDX21もしくはFACTと、Rループの関係性についても、さまざまな方法で調べている。これらが明らかになれば、染色体の安定性がどのようにして維持されているのか、DNAメチル化がそれにどのように貢献しているのかがわかり、ICF症候群の理解のみならず、癌など染色体不安定性が認められるその他の疾患の理解にもつながると考えられる。
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