2019 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of membrane repair mechanism

Research Project

Project/Area Number	18K06965
Research Institution	Sapporo Medical University
Principal Investigator	堀尾嘉幸札幌医科大学, 医学部, 教授 (30181530)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	SIRT1 / 筋ジストロフィー / 細胞膜修復 / 運動 / 骨格筋 / ノックアウトマウス / クレアチンキナーゼ / 筋力
Outline of Annual Research Achievements	C2C12 筋芽細胞の細胞膜修復機構について検討を行った。グラスディッシュ上に細胞を播種して、レーザーを用いて細胞の細胞膜を損傷させ培地に入れた細胞膜非透過性のFM1-43蛍光色素の損傷部位からの細胞内への流入を経時的に観察した。通常、細胞膜は損傷を受けるとすぐに修復機構が働き細胞内への細胞外からのFM1-43蛍光色素の流入は抑制されるが、SIRT1の阻害剤であるニコチンアミドであらかじめ細胞を処理すると損傷部位からの有意な色素流入が観察され、また、同様の現象がSIRT1ノックダウンによっても観察された。生理的にもSIRT1が膜修復に働くことを調べる為、骨格筋特異的SIRT1ノックアウトマウス（SIRT1-MKOマウス：SIRT1flox/flox, strain name B6;129-Sirt1tm1Ygu/J）を作成した。SIRT1-MKOマウスは弱い筋ジストロフィー様の筋病態を示し、中心核をもつ幼弱骨格筋細胞の有意な増加や直径の小さな筋繊維の増加と直径の大きな筋繊維の低下が見られた。また、SIRT1-MKOマウスは運動能力の低下、筋力の低下が見られた。さらに、骨格筋型クレアチンキナーゼの血中濃度の有意な増加と運動による強い増加が見られ、また、運動によって筋損傷の程度の著しい増加が観察された。以上のことからSIRT1が細胞膜修復機構に関与することを初めて見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 当初の目的であったSIRT1の細胞膜修復機構への関与を明らかとして論文を出版したため。
Strategy for Future Research Activity	SIRT1が関与する膜修復機構の分子メカニズムを検討する。SIRT1はタンパク質の脱アセチル化酵素であり、特定のタンパク質を脱アセチル化することにより膜修復にpositiveに作用していることが考えられる。そこで、特に、SIRT1がどのようなタンパク質を脱アセチル化するかをSIRT1抗体を用いた免疫沈降法などを用いて検討する。また、そのタンパク質が膜修復に関与するかどうかを、レーザーを用いたC2C12細胞での膜修復損傷測定法で検討する。測定にはタンパク質のノックダウン法などを用いる。 SIRT1の活性化剤が膜修復を促すかを検討する。活性化剤としてレスベラトロールやNADなどを用いて、レーザーを用いたC2C12細胞での膜修復損傷測定法で検討する。
Causes of Carryover	使用する試薬一式が約20万円ほどと見込まれ、年度内の購入が叶わなかった。次年度予算と合わせて購入し、SIRT1の膜修復に関連があると考えられるSynj2のノックダウンによる影響を検討する。