2018 Fiscal Year Research-status Report
N-myristoylation-induced nuclear localization of proteasome and stress response in tumor microenvironment
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18K06966
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| Research Institution | Gunma Paz University |
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Principal Investigator |
木村 鮎子 群馬パース大学, 保健科学部, 講師 (50553616)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | プロテアソーム / N-ミリストイル化 / プロテオミクス / 癌 / ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らはこれまでの研究から、酵母では、プロテアソームサブユニット中わずか1サブユニットのみで検出されるN-ミリストイル化 (脂質修飾)が、プロテアソームを核内につなぎとめて様々な核タンパク質の分解を促進し、高温などのストレス環境下での生育を増加させることを明らかにしてきた。本修飾は多くの真核生物で保存されているにもかかわらず、酵母以外の生物での役割は不明である。また様々な癌において、タンパク質N-ミリストイル化酵素の発現亢進が認められているが、ミリストイル化と癌との関係も解明されていない。申請者は、上記の知見と、微小環境ストレス下に置かれたある種の癌でプロテアソームの核への蓄積や抗癌剤耐性の発現が認められるとの報告から、N-ミリストイル化の亢進によるプロテアソームの核への異常な蓄積が、核内ユビキチンープロテアソーム系を介した癌の微小環境ストレス耐性の発現や悪性化に関与するのではないかとの仮説のもと、本研究を計画した。本年度は、ヒトがん細胞株におけるプロテアソームのN-ミリストイル化レベルの解析を行うための技術基盤の確立と、本修飾の生理的意義の解析を目指した変異導入細胞株の構築を試みた。N-ミリストイル化の検出においては、まず親和性レジンを用いてプロテアソームを精製し、これをSDS-PAGEで分離した各バンドについて、ゲル内トリプシン消化を行った後にオービトラップ質量分析計を用いて分析し、タンパク質の同定と翻訳後修飾の探索を行った。結果として、多くのプロテアソームサブユニットと翻訳後修飾の検出に成功したが、N-ミリストイル化の検出には至らなかった。また、プロテアソームN-ミリストイル化部位のグリシンを、修飾を受けないアラニンに置換するプラスミドを構築してこれをHEK293T細胞株に導入し、変異導入細胞株の構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
がん細胞株抽出液を用いたプロテアソーム複合体の精製とSDS-PAGEによる各プロテアソームサブユニットの検出に成功し、メチル化・リン酸化・脱アミド化・アセチル化の4種類の翻訳後修飾の検出に成功した。また、当初の予定通り、プロテアソームN-ミリストイル化部位の部位特異的変異導入体の構築を完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の解析で検出できなかったプロテアソームN-ミリストイル化部位の検出を成功させるために、SDS-PAGEゲルからバンドを切り出して調製したペプチド抽出液を用いて、質量分析計を用いた高感度検出法 (多反応モニタリング法)等による検出を試みる。加えて、上記で構築したプロテアソームのN-ミリストイル化部位特異的変異導入細胞株やRNA干渉によってN-ミリストイル基転移酵素の発現抑制を行った細胞株を用いて、プロテアソームの細胞内局在や、微小環境ストレスに関わる種々の表現型変化の有無の解析を進める。
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| Causes of Carryover |
試薬購入費用を想定よりも安く抑えられたこと、学会参加予定を変更したことなどから、次年度使用額が生じた。次年度以降の試薬購入等に充てていく予定である。
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