低分子量G蛋白質Rapシグナル経路のプロテオーム解析を用いた癌浸潤機構の研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06984
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 明石 巧 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (60242202)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: RapG蛋白 / cortactin / 浸潤 / プロテオーム / 質量分析

Outline of Annual Research Achievements

RapG蛋白が癌細胞の浸潤能に与える影響を培養肺癌細胞A549の3次元培養系を用いて実験的に検討した。恒常活性型Rap1B（G12V,G63E）Rap2B（G12V,G63E）不活型Rap1B (S17N)、Rap2B (S17N)、不活性化因子としてRap1GAP,Rap１GAP2全長cDNAおよびそのshRNAをA549細胞に発現させた。RhoG蛋白Cdc42が浸潤を誘導したのに対してRapG蛋白の修飾では浸潤性の変化を見出せなかった。そこで癌細胞の浸潤を制御する分子のプロテオーム探索には癌細胞の浸潤制御分子としてこれまでに代表者が報告を行ったcortactinと結合する分子を対象として実験系の確立を目指した。安定同位体で標識した浸潤性乳癌細胞MDA-MB231にcortactin-ペルオキシダーゼ（APEX）を発現させcortactin結合分子を細胞内でビオチン標識し、ストレプトアビジンビーズで回収、FT-MS/MS（LTQ Orbitrap Velos ETD）を用いて質量分析した。その結果、同定された蛋白は308個、heavy/light比>=2で特異的な結合と考えられた蛋白133個、databaseと照合し乳癌細胞MCF7に比較して浸潤能の高いMDA-MB231で高発現し乳癌症例の予後不良と相関する分子としてGART, ANXA2, GFPT1, VARS, PHLDB2, LUZP1, NCAPG, BAG2, ARHGAP29, MAP1B, MPP1, DYNC1H1が同定された。shRNAを作製しMDA-MB231に発現させ3次元オルガノイド培養系での浸潤能、2次元での細胞運動の変化を検討した結果、GART, ANXA2, GFPT1, VARS, LUZP1, BAG2, ARHGAP29, MAP1Bにおいて浸潤能、運動能の低下が認められ、癌細胞の浸潤制御分子である可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

出芽酵母においてアクチン重合に関与するRapG蛋白が哺乳類の癌細胞においてアクチン重合を介して癌の浸潤を制御しているという仮説を裏付ける結果は得られていない。一方で、申請者がこれまでに癌の浸潤との関連性を検討してきたアクチン結合分子cortactinを対象として結合分子をプロテオーム解析によって網羅的に同定する実験系の確立、shRNAを用いて浸潤能を検討する実験系の確立は概ね順調に進捗した。

Strategy for Future Research Activity

今年度はプロテオーム解析の対象をアクチン線維本体、癌細胞の浸潤に強く影響するRhoG蛋白に広げて、MDA-MB231細胞の浸潤能に影響する分子の同定を幅広く行っていく。RapG蛋白質のヒトの病態への関与の可能性について糸球体疾患におけるRap1GAPの発現を免疫組織学的に検索していく。