悪性黒色腫の浸潤転移機構におけるNFE2L2の役割の解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07022
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 柴崎 晶彦 岩手医科大学, 医歯薬総合研究所, 助教 (20445109)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: NFE2L2 / 活性酸素種 / 浸潤転移機構

Outline of Annual Research Achievements

悪性黒色腫の浸潤抑制は、治療上の大きな課題である。申請者は、これまでの研究より、恒常活性化型NFE2L2遺伝子を強制発現すると、形質転換メラノサイトの浸潤が抑制されるという結果を得ているが、その機序は不明である。そこで昨年度までに、活性化NFE2L2がインテグリン制御に深く関わるPGC1αに対して促進的に働き、腫瘍細胞の足場形成に関与することで浸潤制御する可能を検討した。具体的には、PGC1αを介したインテグリン制御系におけるNFE2L2の関与、さらに、NFE2L2-PGC1α経路を活性化することで浸潤・転移を抑制できるかについて、主に培養細胞を用い検討した。その結果、現段階で以下について明らかとなっている。

（１）ヒト悪性黒色腫細胞株において、抗腫瘍薬であるベムラフェニブはPGC1αの発現を誘導することで浸潤を抑制することが知られている。そこで、ベムラフェニブによるPGC1αの発現誘導効果に対して、NFE2L2活性化がどのような影響を与えるかを、ヒト悪性黒色腫細胞株をもちいNFE2L2活性化剤であるスルフォラファン処理により検討した。その結果、ベムラフェニブによるPGC1α-mRNAの誘導はNFE2L2活性化によって抑制されることが明らかとなった。また、タンパク質レベルでも同様の抑制効果が確認された。
（２）前年度は、NFE2L2活性化による浸潤抑制機構として、オートファジー経路の関与を予想して検討したが実験結果の再現性に問題があったため、今後は実験系を改めて新たな機構を検討する予定である（「今後の研究の推進方策等」を参照）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「研究実績の概要」に示した背景をもとに、NFE2L2による浸潤抑制機序として、PGC1α-ID2-TCF4経路によるインテグリン生成機構へのNFE2L2の関与について、悪性黒色腫培養細胞株を用い分子生物学的な検討をおこなっている。具体的には、NFE2L2活性化剤であるスルフォラファン処理をした細胞を用いて、ウェスタンブロット法と定量PCR法により、タンパク質、mRNAの発現変動量を解析した。その結果、ベムラフェニブによるPGC1α-mRNAやタンパク質の誘導はスルフォラファンによりNFE2L2を安定化することで抑制されることが明らかとなった。
また、NFE2L2を安定化することでメラノーマの転移を抑制できるか、形質転換メラノサイト細胞とヒト悪性黒色腫細胞株にNFE2L2安定化剤であるスルフォラファンを作用させ、マトリゲルを用い浸潤能を解析した。その結果、形質転換メラノサイト細胞では、強い浸潤抑制がみとめられたが、ヒト悪性黒色腫細胞株では、逆に浸潤が亢進する結果が得られた。以上の結果から、今後PGC1αとNFE2L2の関係性を検討する上で、ヒト悪性黒色腫細胞株を主に用いることとした。

Strategy for Future Research Activity

現在までの研究結果から、NFE2L2活性化による浸潤抑制機構として形質転換細胞では当初予想したPGC1α経路以外の経路が関与することが示唆された。一方、悪性黒色腫細胞株においては、既知の通りベムラフェニブでPGC1αが誘導されることが確認され、また、その誘導はスルフォラファンにより抑制されることを見出した。
一方、PGC1αをミトコンドリアに高発現するメラノーマ細胞集団は、転移能が低いことが知られている（Luo C. et al., Nature, 2016.）。さらに、乳がんにおいてミトコンドリアでの活性酸素のレベルが高い細胞集団（MitoSOX陽性細胞群）が存在し、それらは高浸潤能を示すことが示されている（Kenny TC. et al., Cell Reports, 2019.）。以上から、ヒト悪性黒色腫細胞株においても高レドックスである細胞集団が存在し、また、そのような細胞集団ではNEF2L2の安定化によりPGC1α量が減少することで、高浸潤能を獲得しうると予想している。そこで今後は、NFE2L2の結合領域をもつEGFPベクターを安定的に発現した細胞株をもちいて、ミトコンドリアの活性酸素をイメージングするMitoSOX染色等を組み合わせてフローサイトメーターによる解析を行う。

Causes of Carryover

研究内容の軽微な変更を必要とする実験結果が得られたため、数週間、実験作業を中断しその精査を行った。それにより使用残額が生じた。その後研究内容を補正し、現在では方針が確定しているため、前年度残額を含め今年度中に全て使用予定である。