2018 Fiscal Year Research-status Report
新しいANCA関連血管炎動物モデルを用いて同定した血管保護遺伝子の解析
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18K07047
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
濱野 慶朋 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10281354)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小浦 美奈子 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 難治性疾患研究開発・支援センター, 主任研究員 (10370967)
伊藤 吹夕 帝京大学, 公私立大学の部局等, 助手 (20415079)
鈴木 治 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 難治性疾患研究開発・支援センター, 研究リーダー (70235935)
石神 昭人 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究部長 (50270658)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 抗好中球細胞質自己抗体 / MPO-ANCA / ANCA関連血管炎 / 自然発症マウス / SCG/Kj / ANCA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)の持続的産生がANCA関連血管炎(AAV)の原因である。我々はANCA産生機構の解明のため、AAV自然発症モデルマウスSCG/Kj由来のANCA産生感受性遺伝子座Scg-2/Man-1の導入実験と、Scg-2/Man-1領域のエクソーム解析により見出されたMan-spa遺伝子変異の機能解析を行い、以下の結果を得た。
（１）Scg-2/Man-1をB6.lprマウスに導入したSICMマウスの解析により、この遺伝子座がMPO-ANCA産生・半月体形成性腎炎・血管炎の発症をもたらすことを証明した（論文投稿中）。
（２）Man-spa遺伝子変異の機能解析 Man-spa遺伝子は、プロテアーゼを抑制して細胞を保護する遺伝子群であり、これらのアミノ酸置換を伴う変異がMan-spa変異である。A. リコンビナントマウス(rm)Man-spaの作製 1. SCG/Kj由来の変異型・B6由来の正常型Man-spaをクローニングした。2. 人工遺伝子の合成とクローニング：大腸菌に適した人工遺伝子を合成し、発現ベクターにクローニングした。3. rmMan-spaの作製：大腸菌培養条件・試薬組成を最適化し、正常型・変異型rmMan-spaを得た。B. 変異Man-spaの機能変化の解析 4. rmMan-spaのプロテアーゼ阻害活性の確認：rmMan-spaがTrypsin・CathG・HNE・PR3の活性を阻害することを確認した。C. SICMによるAAV病態の解析 5. SICMはMPO-ANCA産生や腎炎を発症し、血管炎がヒトと同様に肺に好発することが判明した。
これらの結果を、
（３）H31（R元）年度の計画： Man-spa機能解析（細胞レベル）、SICMを用いた正常・変異Man-spaの投与実験につなげていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)の持続的産生がANCA関連血管炎(AAV)の原因である。我々はANCA産生機構の解明のため、AAV自然発症モデルマウスSCG/Kj由来のANCA産生感受性遺伝子座Scg-2/Man-1の導入実験と、Scg-2/Man-1領域のエクソーム解析により見出されたMan-spa遺伝子変異の機能解析を行い、以下の結果を得た。
（１）Scg-2/Man-1をB6.lprマウスに導入したSICMマウスの解析により、この遺伝子座がMPO-ANCA産生・半月体形成性腎炎・血管炎の発症をもたらすことを証明した（論文投稿中）。
（２）Man-spa遺伝子変異の機能解析 Man-spa遺伝子は、プロテアーゼを抑制して細胞を保護する遺伝子群であり、これらのアミノ酸置換を伴う変異がMan-spa変異である。A. リコンビナントマウス(rm)Man-spaの作製 1. SCG/Kj由来の変異型・B6由来の正常型Man-spaをクローニングした。2. 人工遺伝子の合成とクローニング：大腸菌に適した人工遺伝子を合成し、発現ベクターにクローニングした。3. rmMan-spaの作製：大腸菌培養条件・試薬組成を最適化し、正常型・変異型rmMan-spaを得た。B. 変異Man-spaの機能変化の解析 4. rmMan-spaのプロテアーゼ阻害活性の確認：rmMan-spaがTrypsin・CathG・HNE・PR3の活性を阻害することを確認した。C. SICMによるAAV病態の解析 5. SICMはMPO-ANCA産生や腎炎を発症し、血管炎がヒトと同様に肺に好発することが判明した。
これらの結果を、
（３）H31（R元）年度の計画： Man-spa機能解析（細胞レベル）、SICMを用いた正常・変異Man-spaの投与実験につなげていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
H31年度の計画：Man-spa機能解析（細胞レベル）、SICMを用いた正常・変異Man-spaタンパクの投与実験
A.正常・変異Man-Spaタンパクの細胞保護活性: 1.正常・変異Man-Spaタンパク添加、もしくは抗Man-Spa抗体添加により、活性化顆粒球による細胞傷害試験への影響をみる。（標的細胞：マウス初代血管内皮細胞、マウスEND-D株、ヒトHUVEC他）2.好中球クロマチン網（NETｓ）による細胞傷害への影響をみる。3.細胞傷害系において、Man-Spaの強制発現、ノックダウンの影響をみる。
B.SCG/KjおよびSICM個体におけるMan-Spa補完実験、抑制実験: 1.SICMに、正常Man-Spaタンパクを投与し、疾患の改善をみる。2.B6およびAAVモデルマウスに抗Man-Spa抗体を投与し、AAV発病や疾患の変化をみる。（モデルマウスはSICMほか、SCG/Kj、MRL/lpr、BXSBなど）
C.Man-spa欠損マウスによるAAV再現実験とヒト型Man-spa投与実験: 1.Man-spa欠損マウスを作製しANCA産生と腎炎・血管炎の再現実験を行う。2. ヒトMan-Spaタンパクを産生し、活性化顆粒球やNETsによる細胞傷害試験への影響、AAVモデルマウスへの投与実験を行う。これらを発展させ、リード薬作製へつなげていきたい。
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| Causes of Carryover |
SCG/Kjマウスの遺伝的交配実験により見いだしたMPO-ANCA産生感受性遺伝子の本体Man-spaのクローニングとリコンビナントタンパク合成が可能となり、これから酵素活性を調べる生化学的解析、好中球機能・NETs形成に対する機能、血管炎モデル動物（自然発症マウス・それ以外のモデル動物）に投与し治療効果を検討する段階に入っていく予定である。
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[Journal Article] Efficacy of a recombinant single-chain fragment variable region, VasSF, as a new drug for vasculitis.2019
Author(s)
Kameoka Y, Kishi F, Koura M, Yamakawa Y, Nagasawa R, Ito F, Matsuda J, Suzuki O, Nakayama T, Suzuki K
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Journal Title
Drug Des Devel Ther.
Volume: 13
Pages: 555-568
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Vasculitis and glomerulonephritis in a newly established congenic mice strain derived from ANCA-associated vasculitis-prone SCG/Kj mice2019
Author(s)
Yoshitomo Hamano, Fuyu Ito, Osamu Suzuki, Minako Koura, Shuji Matsuoka, Toshiyuki Kobayashi, Yoshinobu Sugitani, Nadila Wali, Okio Hino, Yosuke Kameoka, and Kazuo Suzuki
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Journal Title
Rheumatology
Volume: 58, suppl. 2
Pages: 76-76
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[Journal Article] 肺結節性病変の中に小血管炎と著明な好酸球浸潤を認めたPR3-ANCA陽性の一例.2018
Author(s)
濱野 慶朋, 梶野 一徳, 林 大久生, 佐伯 春美, 松岡 周二, 小林 敏之, 杉谷 善信, 折茂 彰, 岸川 さつき, 荒川 敦, 樋野 興夫, 八尾 隆史.
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Journal Title
脈管学
Volume: 58
Pages: 36-36
Peer Reviewed
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