2020 Fiscal Year Research-status Report
新しいANCA関連血管炎動物モデルを用いて同定した血管保護遺伝子の解析
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18K07047
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
濱野 慶朋 順天堂大学, 医学部, 非常勤講師 (10281354)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小浦 美奈子 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 難治性疾患研究開発・支援センター, 主任研究員 (10370967)
伊藤 吹夕 帝京大学, 公私立大学の部局等, 助手 (20415079)
鈴木 治 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 難治性疾患研究開発・支援センター, 研究リーダー (70235935)
石神 昭人 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究部長 (50270658)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | MPO-ANCA / ANCA関連血管炎 / SCG/Kjマウス / NETs / Man-1 / Quantitative trait loci |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗好中球細胞質自己抗体(ANCA)の持続的産生がANCA関連血管炎(AAV)の原因である。我々はANCA産生機構の解明のため、AAV自然発症モデルマウスSCG/Kj由来のANCA産生感受性遺伝子座Scg-2/Man-1の導入実験、Scg-2/Man-1領域のエクソーム解析により見出されたMan-spa遺伝子変異の機能解析、Man-1支持区域の網羅的発現解析を行い、以下の結果を得た。
（１）Scg-2/Man-1をB6.lprマウスに導入したSICMマウスの解析により、この遺伝子座がMPO-ANCA産生・半月体形成性腎炎・血管炎の発症をもたらすことを証明し報告した（Autoimmunity 52:208,2019）。（２）Man-spa遺伝子変異の機能解析 Man-spa遺伝子は、プロテアーゼを抑制して細胞を保護する遺伝子群である。A. リコンビナントマウス(rm)Man-spaの作製：1.変異型(SCG/Kj)・正常型(B6)をクローニングし高純度の正常型・変異型rmMan-spa を70mg程度ずつ合成した。B. Man-spa遺伝子欠損によるANCA産生を証明するため、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集にてMan-spa欠損マウスを作製・交配してB6ベースおよびB6/lprベースの個体を繁殖し、in vivo解析の準備を完了した。（３）NGSを用いて高ANCA・低ANCAと関連する遺伝子発現を解析した。この結果、ヒトAAVに関連する珪素に関わる遺伝子の発現が有意に変動することが判明し、候補遺伝子として解析予定である。
H33（R3）年度の計画：Man-spa欠損マウスおよびSICMを用いて、Man-spaのANCA産生を含む自己免疫への影響、およびrmMan-spaの補填による形質の変化を解析してAAVにおけるMan-spaの役割を明らかにしていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
（１） rmMan-spaの作製と解析、SICM・B6の比較に基づくAAV病態解析：①rmMan-spaの作製：大腸菌大量調整と精製により、正常型および変異型のrmMan-spaをそれぞれ70mg合成し得た。②SICMと正常マウス（B6）との比較によるAAV病態の解析：Scg-2/Man-1をB6/lprマウスに導入したSICMマウスの解析により、この遺伝子座がMPO-ANCA産生・半月体形成性腎炎・血管炎の発症をもたらすことを証明し報告した（Autoimmunity 52:208,2019）。
（２）正常・変異Man-Spaタンパクの機能解析・細胞保護活性：高純度のrmMan-spaタンパク合成までに時間を要したので、これらの機能解析・細胞保護作用を今後進めていく。予備実験としてrmMan-spaによるタンパク分解酵素阻害活性を解析した。変異型は正常型に比べタンパク分解酵素の一部に対する阻害作用が低い傾向が認められた。活性化顆粒球による細胞傷害やNETｓ形成への影響を今後解析していく。
（３）SCG/KjおよびSICM個体におけるMan-Spa補填実験、抑制実験：SICMや他のAAVモデルマウスへのMan-Spaタンパク・抗Man-Spa抗体投与による疾患形質の解析は今後の課題である。
（４）Man-spa欠損マウスによるAAV再現実験とヒト型Man-spa投与実験：Man-spa遺伝子欠損によるANCA産生を証明するため、B6およびB6/lprベースのMan-spa欠損マウスを作製し個体を得てin vivo解析の準備を完了した。これらより個体を得てMPO-ANCA産生への影響を解析していく。ヒトMan-Spaタンパクを産生し、活性化顆粒球やNETsによる細胞傷害試験への影響、AAVモデルマウスへの投与実験を行う。これらを発展させ、リード薬作製へつなげていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
（I）高純度の正常型・変異型rmMan-spaタンパクの合成が完了し、このアミノ酸変異の影響を、生化学的活性、および活性化顆粒球による細胞傷害やNETｓ形成の変化、in vivoにおける疾患形質への影響を検討し解析していく。
（II）SCG/KjおよびSICM個体におけるMan-Spa補填実験、抑制実験
SICMや他のAAVモデルマウスへのMan-Spaタンパク・抗Man-Spa抗体投与による疾患形質の変化を解析していく。
（III）Man-spa欠損マウスによるAAV再現実験とヒト型Man-spa投与実験
ゲノム編集によりMan-spa欠損マウスを作製し、B6およびB6/lprベースのMan-spa欠損マウスを作製し個体を得てin vivo解析の準備を完了した。これによりMPO-ANCA産生への影響を解析していく。ヒトMan-Spaタンパクを産生し、活性化顆粒球やNETsによる細胞傷害試験への影響、AAVモデルマウスへの治療的投与実験を行う。折しも、新型コロナウイルス感染がパンデミックとなっており、感染者の急速かつ重篤な全身炎症が広く報告されている。この遺伝子が持つタンパク分解酵素阻害活性は、治療薬開発の糸口となる可能性もある。これらを発展させ、リード薬作製へつなげていきたい。
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| Causes of Carryover |
高純度の正常型・変異型rmMan-spaタンパクの合成が完了し、このアミノ酸変異の影響を、生化学的活性、活性化顆粒球による細胞傷害やNETｓ形成の変化、in vivoにおける疾患形質への影響を解析する準備が整った。
ゲノム編集によりMan-spa欠損マウスを作製し、B6およびB6/lprベースのMan-spa欠損マウスを作製した。交配・繁殖したマウス個体数が多く、遺伝子タイピングと継代に手間取ったが、in vivo解析の準備を完了した。これによりMPO-ANCA産生を含む自己免疫への影響を解析していく。折しも、新型コロナウイルス感染がパンデミックとなっており、感染者の急速かつ重篤な全身炎症が広く報告されている。この遺伝子が持つタンパク分解酵素阻害活性は、治療薬開発の糸口となる可能性もある。これらを発展させ、リード薬作製へつなげていきたい。
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Research Products
(2 results)
