2019 Fiscal Year Research-status Report

Research on pathogenesis and development of therapies for cardiac failure using dystrophin-deficient-cardiomyocytes derived from DMD patients

Research Project

Project/Area Number	18K07064
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	宮崎大吾信州大学, 医学部附属病院, 講師(特定雇用) (80596370)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中村昭則信州大学, 医学部, 特任教授 (10303471) 柴直子信州大学, 医学部, 助教(特定雇用) (00639289) 柴祐司信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (70613503)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	デュシェンヌ型筋ジストロフィー / 心筋細胞 / 心不全
Outline of Annual Research Achievements	DMD遺伝子にエクソン46-55欠失を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）患者の末梢血からiPS細胞を樹立し、分化誘導により心筋細胞（DMD-iPSC-CMs）を作成した。このDMD-iPSC-CMsと健常対象由来の心筋（Control-iPSC-CMs）へのマイクロアレイ解析とqPCR解析による比較検討から細胞増殖や再生に関与する複数の候補遺伝子を見出した。また、DMD-iPSC-CMsに対してDMD遺伝子エクソン45特異的なモルフォリノオリゴを用いたエクソン45スキップを行うことでアウトオブフレーム型からイン・フレーム型に誘導し、欠損していたジストロフィンのタンパク発現回復が起こることを確認した。さらに、エクソン45スキップによって、DMD-iPSC-CMsにおいて上記候補遺伝子の中で特にTMSB4XとIGF2の遺伝子発現が回復することが確認できた。これらの研究結果からDMDにおける心筋障害の進展にTMSB4XやIGF2といった遺伝子の発現変化が関与している可能性を考えておりTMSB4XとIGF2の発現低下に伴う心筋障害のプロセス解明のためこれらの遺伝子に対するsiRNAを用いた遺伝子ノックダウンを試みている。HEK293細胞に対してTMSB4X、IGF2遺伝子に対するsiRNAをリポフェクタミン試薬を用いて導入を行い、いずれも85％-90%の遺伝子発現抑制効果を確認できた。また、TMSB4X遺伝子発現抑制によりIGF2遺伝子発現が抑制され、2つの遺伝子の作用に関連があることが確認できた。現在iPS心筋を用いた検討を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今までTMSB4XとIGF2に対するsiRNAの導入によっても十分な遺伝子発現抑制効果が得られていなかったが、遺伝子導入試薬の変更と細胞数調整によって85%-90%と十分な遺伝子発現抑制効果が安定して得られるようになった。このため現在は心筋細胞を用いた研究を行っている。
Strategy for Future Research Activity	iPS心筋に対するTMSB4X、IGF2遺伝子抑制に伴う心筋細胞の細胞内シグナル変化や細胞機能の変化に関して評価し、TMSB4XとIGF2の発現低下に伴う心筋障害のプロセス解明につなげる。
Causes of Carryover	次年度でiPS心筋細胞における遺伝子抑制による影響を評価するため、心筋培養とカルシウムイメージングを用いた心筋細胞機能評価を集中して行う必要がある。このため次年度に124,860円を繰り越した。