2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞間相互作用を介した肝再生機構の解明と再生肝細胞の起源の同定
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18K07079
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
鈴木 亨 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (50334280)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 肝再生 / 肝臓形成 / 細胞外膜成分 / RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CNOT複合体はmRNA分解を促進する活性を有し、遺伝子発現量を制御することで細胞・組織の恒常性維持に関わる。その構成因子Cnot3を肝臓特異的に抑制したマウスは、肝炎・肝細胞壊死等の症状を呈するが、その後の成長過程で肝再生により回復する。詳細な変遷を調べたところ、生後4週から8週にかけて肝臓は最も重篤な症状を示し、生後12週まで成長するとかなり正常に近い組織像に戻っていることが分かった。遺伝子発現解析、血液検査の結果もその傾向と一致していた。同様に、各週齢において、非肝細胞を標識した蛍光物質を発現する細胞の分布を調べたところ、生後4週の肝臓内は殆どが肝細胞の蛍光標識を発現する細胞で占められており、非肝細胞に相当する蛍光標識は血管、及びその周辺にのみ観察された。血管内部の発光強度は強いものの、ほぼ正常の肝臓に類似した分布と考えられる。生後8週になると非肝細胞を標識した蛍光物質を発現する細胞が肝実質に観察され、肝細胞に相当する形態も示していた（新生肝細胞と記述する）。新生肝細胞は生後12週、16週と進むにつれて増加傾向にあった。一方、週齢が40週辺りまで進んでもすべての肝実質が新生肝細胞に入れ替わることは無いということもわかった。以上を踏まえて、生後8，12週の遺伝子改変マウスの肝臓から、フローサイトメトリーによる肝細胞、新生肝細胞の分取を試みた。遺伝子型の確認をすると、肝細胞はCnot3欠損型、新生肝細胞は野生型であり、イムノブロットでも同様のことが確認できた。
一方、3,5-ジエトキシカルボニル-1,4-ジヒドロコリジンを含有した餌を与えて肝障害を誘導し、その後通常食に戻して肝再生を促す系を用いて、同様に非肝細胞の挙動を調べた。しかし、非肝細胞に相当する蛍光標識を発現する細胞が肝実質に現れることはなく、Cnot3欠損では異なる肝再生様式が使用されていることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
肝臓特異的Cnot3欠損マウスの肝臓から充分な数の生存肝細胞を得るのが、野生型マウスの肝臓に比べるとかなり困難であった。肝障害、肝再生反応の繰り返しに伴って生じる線維化が影響していると思われ、細胞の分散が不十分なことが一つの原因であった。さらにフローサイトメトリーによる肝細胞、新生肝細胞の分取においても、想定以上に時間を要したため、得られた細胞の状態が良好ではなかった。その結果、イムノブロットやゲノムPCRの実施は可能である一方、信頼できる解析結果を得るのに必要な純度のRNAを調製することが困難であった。現在は、用意するマウス個体数を増やすことや、密度勾配遠心法による分画の条件検討を行うことで改善しつつある。
細胞外膜小胞（EV）の調製、そこからのRNA調製は、超遠心法や市販の調製用キットなどこれまでの実施例を参考にしていくつか試行した。その結果、エクソソームについては有効な手法をほぼ突き止めることができた。大きいサイズのEVであるmicrovesicle (MV)はマウスの血清・血漿から充分は量を得ることは困難に思われたので、まずはエクソソームに焦点を当てて進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の検討によって、肝臓特異的Cnot3欠損マウスの肝臓からの肝細胞調製の条件をより詳細に設定することができたので、引き続き蛍光標識を使用した肝細胞、新生肝細胞の分取に取り組む。フローサイトメトリーで得られた細胞の遺伝子型解析、イムノブロットの予備的な結果は、肝細胞、新生肝細胞を完全に純粋なものとして分取できていない可能性も示唆していた。一細胞解析や組織切片からの直接分取といった手法の方が精度高く比較できる可能性もあるので、併せて検討していく。その後、質量分析・RNA発現解析を実施する。肝細胞のマーカーであるHNF4やAlb、肝臓内で領域依存的な発現を示す酵素に対する免疫組織染色を行って、再生肝細胞中の肝細胞と新生肝細胞で相違があるかどうか、また新生肝細胞の存在位置に特徴があるかどうかを調べていく。
正常個体とCnot3欠損の血清、血漿からエクソソームを調製して内容物（タンパク質、RNA）を比較する。RNAシークエンス解析や質量分析を計画しているが、それに先立って、肝臓関連因子やストレス応答因子などが含まれるのかどうか、含まれる場合は発現量に相違があるかどうかを確認する。化学物質処理によって肝障害を誘発させた個体についてもエクソソームを調製する。肝障害発生時から再生過程のいくつかの段階から採取する。内容物（タンパク質、RNA）をCnot3欠損マウスと比較して肝再生様式の違いを説明できる要因があるかどうか探索する。エクソソームに特異的な因子に相違がある可能性も検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究計画の発想の基礎となり、今後の研究を遂行する上で重要な参考になる成果論文の発表（実績欄参照）において、多くの実験材料（マウス）を使用する必要が生じたことによって、実施実験の内容に多少の変更があった。また、進捗欄の記載にある通り、実験の条件検討に多くの時間を要したことで、RNA解析・質量分析等の実施まで進行していないことが要因に挙げられる。本年度は、以上の想定している実験を実施する段階まで進むことによって、次年度使用額、及び本年度請求分を使用する計画である。
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