2018 Fiscal Year Research-status Report
レプトスピラ症病原体の宿主選好メカニズムに関する研究
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18K07100
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中村 修一 東北大学, 工学研究科, 助教 (90580308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小泉 信夫 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (10333361)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細菌運動 / 感染症 / 宿主選好性 / レプトスピラ症 / 人獣共通感染症 / 接着 / 顕微計測 / 生物物理学的解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レプトスピラ属細菌は250以上の血清型に分類され、様々な哺乳動物に経皮的に感染する。感染後の症状は動物種によって異なり、一部の動物ではレプトスピラが腎臓に持続的に感染し、保菌動物となる。保菌動物は本症拡大の主因であるため、「どの血清型がどの動物に持続感染できるか」という各血清型の選好性（宿主との相性のようなもの）を理解することは、感染拡大の抑止を狙う創薬においても重要課題であるが、そのメカニズムは未だ明らかにされていない。本研究では、レプトスピラの宿主選好性を決める可能性因子として、「動物組織への接着性」と「接着後の運動性」の２つを挙げ、これらの実験的検証を行うこととした。
採択後早々に、動物細胞の単層シート作製に着手した。レプトスピラの主要保因動物であるラットの腎臓細胞（NRK）と、ヒトに身近な感染動物であるイヌの腎臓細胞（MDCK）を顕微鏡観察用チャンバー内に単層培養する手法を確立した。ラットとイヌに対して、非感染性、不顕性感染性（維持感染）、病原性のいずれかを示すいくつかのレプトスピラ血清型を選別し、それらに対する蛍光タンパク質遺伝子導入を試みた。いくつかの蛍光タンパク質について発現効率と蛍光強度を比較し、緑色蛍光タンパク質GFPを使用することに決めた。しかし、計測可能な蛍光強度を示す血清型は数種類に限られたため、本研究では、病原性2株と非病原2株を使用することとした。レプトスピラ３株と動物細胞２種を組み合わせて、細胞上でのレプトスピラの接着と運動を１細胞レベルで計測したところ、病原性発揮ペアは、非感染性ペアに比べて、接着性と運動性がともに高いという、動態因子と病原性の間に相関がみられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度には、蛍光タンパク質導入株の作製と、計測システムの構築を予定していた。研究分担者・小泉信夫（国立感染症研究所）が中心となって行った複数のレプトスピラ血清株に対する蛍光タンパク質導入は、蛍光タンパク質の選別や血清型の選別などで多くの問題が生じたが、条件検討の結果、現段階では、宿主選好性の議論に役立つ数種類の血清型についてGFP発現株が得られている。研究代表者（中村）が担当した動態計測については、顕微鏡系、解析プログラムの検討を小泉の進捗に合わせて進め、個々の細胞の動態を精度よく定量化できるシステムの構築に成功した。これらの実験系が比較的早期に確立できたため、次年度に行う予定であった動物細胞上でのレプトスピラの動態解析に本格的に着手した。データ解析にあたっては、特に接着を定量化するための手法について再検討を要したが、遊泳（非接着）細胞および接着細胞の割合から“遊泳―接着”の反応の平衡定数を算出するなどの生物物理学的解析を導入することで、いくつかの血清型―動物細胞ペアでのレプトスピラの接着性を定量評価する手法を確立した。接着と運動が重要な病原性因子であることは以前から知られていたが、これまでの知見は、運動欠損株を動物細胞に与えて病原性の有無を判断する動物実験で得られたもので、レプトスピラの感染および病原性発揮において、接着と運動が具体的にどのように関わるかは全く分かっていなかった。初年度に得られた成果は、レプトスピラの病原性における接着と運動の直接的な関与を示す実験的証拠である。初年度に予定していたPDMS（ポリマー）製微小流路内での動物細胞シート構築は、未だ条件検討中で完了していないが、本研究の目的達成に大きく近づく手がかりを初年度で既に得ることができたこと、得られた成果が高いインパクトを持つことなどを理由に、「当初の計画以上に進展している」と自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究で浮き彫りになったのは、GFP導入レプトスピラの作製における問題である。初年度には医学・獣医学的に重要ないくつかの血清型を選別して、gfp遺伝子の導入を試みた。しかしながら、遺伝子の導入がうまくいかない（抗生物質マーカーを用いたスクリーニングでコロニーが得られない）、遺伝子は導入されるがタンパク質が発現しない、タンパク質は発現するが蛍光強度が弱いなど血清型毎に異なる様々な問題が生じ、現段階で得られている動態計測に利用可能なGFP発現株は４種のみである。しかしながら、これら以外にもまだ多くの重要な血清型があるため、今後は蛍光タンパク質発現株の作製をさらに進め、できるだけ多くの血清型について、病原体のキネティック特性（接着の強さや運動性など）と宿主選好性の関係を議論したい。GFP発現株の作製は、初年度に引き続き、研究分担者（小泉）と協力して行う。血清型－動物種のペアを増やすもう一つの策として、動物細胞の種類を増やす予定である。牛や猿の腎臓細胞の利用を検討中である。
初年度に完了しなかった微小流路の作製も行う。PDMSを用いた流路作製法は確立したので、使用する細胞に合わせた流路サイズの検討を行い、微小流路内に形成した細胞シート上でのレプトスピラ動態を解析する。
病原因子または接着因子についてのレプトスピラ変異体の作製にも着手したいと考えている。トランスポゾンを用いたランダム変異導入法によるゲノムワイドな変異体作製法は、我々の以前の研究において既に確立されている。この手法によって弱毒株などを得て、それらのキネティック特性を調べる。
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