Analysis of the pMG1-like highly conjugative plasmids in vancomycin-resistance enterococci

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K07101
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 富田 治芳 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70282390)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 腸球菌 / 伝達性プラスミド / 病原性（定着能） / 菌体凝集

Outline of Annual Research Achievements

これまでに新規バンコマイシン耐性高頻度接合伝達性プラスミド（pMG1型プラスミド）の高頻度伝達性に関与すると考えられる接合凝集性の責任領域を同定した。これらの凝集塊の形成に関与する領域の発現クローンを用い、in vitroの付着アッセイ系を用い解析したところ、各種細胞外マトリックスへの明らかな付着性への関与（増強）は認められなかった。この領域内の最大のORFの欠失プラスミドを作成し、腸球菌に導入した。この株は元の野生型プラスミドを保持する株と比較し、液体培地中での菌凝集の減弱を認めたことから、凝集関連遺伝子と考え、traIと命名した。このtraIの遺伝子発現を調べたところ、直上および下流の遺伝子群と共にオペロンを構成していること、および直情に存在するORF上流のプロモーター活性が極めて強いことから、このプロモーター領域が接合凝集関連遺伝子の発現に重要であることが推定された。またtraI上流で強力なプロモーター領域の直下に存在するORFについて、その欠失プラスミドを構築した。このプラスミドを保持する株は液体培地中での接合凝集性の消失と同時に、固形倍地上での接合伝達性も完全に失われ、このORFはプラスミドの伝達に必須であることから、新たにtraDと命名した。
一方、国外で分離されたVRE株から複数の高頻度接合伝達性プラスミドを分離した。それらのプラスミドは新規の高頻度接合伝達性プラスミドに特異的なtraA遺伝子を保持しており、pMG1型プラスミドであることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

腸球菌のpMG1型新規高頻度接合伝達性プラスミドの高頻度伝達性に重要と考えられる接合凝集領域のうち、凝集に関する遺伝子を同定した。それらの転写活性（オペロン構造）、プロモーター領域を明らかにし、凝集性と伝達性に必須の遺伝子traDを新たに同定できた。
一方で、国外のVRE株に存在する高頻度接合伝達性プラスミドを複数分離し、それらがpMG1型の新規高頻度接合伝達性プラスミドと類似であり、国外にもpMG1型プラスミドが広く存在することを明らかにした。

Strategy for Future Research Activity

大腸菌など他の細菌種に存在する高頻度接合伝達性プラスミドや腸球菌のフェロモン反応性高頻度接合伝達性プラスミドには、接合伝達を制御する複雑な調節機構が存在していることが知られている。本研究対象である新規の伝達性プラスミドにおいても、凝集蛋白の遺伝子発現に関与する調節遺伝子が存在することが推察される。これにつて今回決定した凝集関連遺伝子（traIとtraD）の発現について詳細な解析を行なう。これにより高頻度接合伝達性を制御している因子を同定し、詳細を明らかにすることで、耐性遺伝子の伝播、および菌の定着性の制御を行なうことを目指す。また国外のVREから分離された複数のpMG1型高頻度接合伝達性プラスミドの構造を明らかにし、それらの関連性を解析する予定である。