2019 Fiscal Year Research-status Report
ボツリヌス毒素の体内侵入機構を利用した粘膜ワクチンの開発
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18K07107
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
松村 拓大 金沢大学, 医学系, 講師 (00456930)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ボツリヌス / 神経毒素複合体 / HA / ムチン / 経粘膜ワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ボツリヌス毒素はボツリヌス菌から産生される神経毒素であり、常に無毒成分との複合体として産生される。ボツリヌス食中毒はこの無毒成分複合体を経口摂取することにより発症する。我々はこれまでに血清型A型毒素が生体防御を担う細胞であるMicrofold cell（M細胞）から体内に侵入すること、およびB型神経毒素複合体がA型とは異なる体内侵入機構を持つことを明らかにしてきた。本研究では、血清型間の腸管吸収機構の違いに関与する因子を同定することにより、各血清型毒素の体内侵入機構を明らかにし、それらの吸収（侵入）機構を利用した新しい経粘膜薬物送達システム・粘膜ワクチンの開発を目指す。
昨年までの解析から、腸管に存在するムチン層との相互作用の違いが血清型A型とB型神経毒素複合体との腸管吸収機構の違いに寄与していることが考えられた。神経毒素複合体は無毒成分HAを介してムチン層と結合しており、この結合活性はA型と比較してB型は著しく低い。故にB型は効率よくムチン層を通過できるため、腸管の柔毛上皮（VE）やリンパ濾胞上皮（FAE）から多くの毒素が吸収されることが考えられる。実際に生体（マウス腸管）内での神経毒素複合体とムチンの局在を解析した結果、A型は多くがムチン層内に局在しているのに対し、B型はムチン層を通過し、上皮に結合している様子が観察された。次に、HAを構成するサブコンポーネント（HA1、HA2、HA3）のどれがムチンとの相互作用において重要なのかを明らかにするために、A型とB型それぞれのサブコンポーネントを用いてキメラHAを作成した。キメラHAとムチンとの結合を解析した結果、HA1とHA3がムチンとの相互作用に重要であり、A型とB型との結合の差に寄与していることが明らかとなった。特にHA1の寄与度が高く、HA1の持つ糖鎖結合活性がムチンとの相互作用に重要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ボツリヌス神経毒素複合体の腸管吸収に寄与している毒素側および宿主側の因子を明らかにすることにより、血清型間の吸収機構の違いが明確になり、それぞれの機構の特徴を生かした経粘膜薬物送達システムへの応用が可能である。本年度は、実際の生体内におけるA型およびB型神経毒素複合体の局在を解析し、in vitroの結果と相関性があることを確認した。またA型とB型HAのサブコンポーネントを用いたキメラHAを作成し、ムチンとの結合および血清型間の結合活性の違いに寄与しているサブコンポーネントを同定することができた。今後はHAとムチンとの相互作用についてin vitroおよびin vivoの系を用いて詳細な解析を進め、ワクチン輸送担体候補としてのHAを決定し、その免疫賦活効果を検証する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの解析結果から、HAとムチンとの相互作用の違いが血清型間の腸管吸収および毒性の違いに関与していることが示唆されている。さらに、キメラHAを用いた解析結果から、サブコンポーネントHA1およびHA3がその違いに寄与していることが考えられた。今後は、キメラHAのムチン層の通過（in vitro）およびマウス腸管内局在（in vivo）を解析することにより、各サブコンポーネントのムチンとの相互作用や腸管吸収における役割について明らかにしていきたい。またHA1およびHA3は糖鎖結合活性（レクチン活性）を持つことが知られている。これらの活性を消失させた変異体を作成し、この活性の役割についても確認する予定である。一方で、A型HA、B型HA、キメラHA、変異体HAを用いたムチンとの結合、透過、腸管内局在等の比較解析からワクチン輸送担体候補としてのHAを決定し、その効果について解析を進めていく予定である。
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