2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of substrate recognition mechanism of bacterial collagenases to develop angiogenic drug seeds
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18K07111
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
松下 治 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00209537)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
美間 健彦 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (80596437)
内田 健太郎 北里大学, 医学部, 講師 (50547578)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ガス壊疽菌群 / 細菌性コラゲナーゼ / 基質アンカー / 多発性嚢胞腎(PKD) / 構造生物学 / 歯槽骨 / 骨新生 / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ガス壊疽菌群の細菌性コラゲナーゼの基質アンカー・モジュールはPKDとCBDよりなる。トロポコラーゲン分子の束である不溶性線維に本モジュールがどのように結合するかを明らかにするため、ColG酵素由来のアンカーPKD-CBD1-CBD2とコラーゲン様ペプチドの複合体の構造をX線小角散乱法により決定した。CBD2はペプチドのC末端に結合していた。また、CBD1は別のコラーゲン分子に結合し、PKDはC末端より下流に触媒モジュールを配置して加水分解することを示唆する結果が得られた（論文１）。
他方、ColH酵素由来のアンカーPKD1-PKD2-CBDとコラーゲン様ペプチドとの複合体の構造をX線小角散乱法により決定したところ、CBDはコラーゲン様ペプチドのC末端に、両PKDはいずれもそのN末側に結合すると考えられる結果が得られた。PKD２ではβサンドイッチの片側のシートで４つの疎水性残基が露出しており、これらが結合に寄与すると考えられた。そこで、NMR perturbationによりこれを証明するため、15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDを生産した。これらのタンパク質を国際共同研究先のアーカンソー大学化学生化学部のJoshua Sakon博士に送付して、二次元15N HSQCスペクトルの測定に着手した。また、PKD-CBDの結晶作製にも着手した。
コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞成長因子(CB-bFGF)の臨床応用では、歯周病による歯槽骨の水平欠損部に対してCB-bFGF固相化コラーゲンを充填することで、ｂFGF単体に比し有意な骨形成を部位特異的に誘導できることをmicro CTおよび組織学的に示した。また、オステオカルシン、proliferating cell nuclear antigen、およびオステオポンチン陽性細胞が増加したことを示した（論文２）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
国際共同研究先より大学院生のPerry Caviness氏を受け入れ、種々の基質アンカーの野生型および変異体を作製した。ColG酵素由来アンカーでは、計画どおり新たにPKD-CBD1-CBD2とコラーゲン様ペプチドの複合体の構造をX線小角散乱法により決定することができた。PKDの配置方向は予想とは全く逆であったが、そのことを含め論文１として発表することができた。
また、研究開始当初は、ColH酵素由来アンカーの15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDの生産効率が低く、核磁気共鳴法(NMR)による構造決定が危ぶまれた。非標識塩とグルコースを用いて最小培地の組成と培養条件を工夫することで解析に必要な量の生産・精製を行うことができた。15N/13C標識効率はいずれも96%程度と十分であった。
コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞成長因子(CB-bFGF)とコラーゲン・パウダーからなる複合材料をもちいた歯槽骨の再生では、当初の予想以上の成果を飛躍的に得ることができ論文２として発表できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
学生を2019年５月より３か月間国際共同研究先に派遣し、ColH酵素由来アンカーの15N標識PKD2-CBDおよび15N/13C標識PKD2-CBDの主鎖の帰属を進める予定である。その後、コラーゲン様ペプチド（早稲田大学先進理工学部小出隆貴教授生産済）を用いてNMR perturbation assayを行い、PKD2の基質結合に関与する残基を網羅的に決定する予定である。
また血管新生シーズについては、血管内皮細胞増殖因子(VEGF-A)をHisタグを用いた大腸菌系により生産する予定である。化学的クロスリンカーをPKD2-CBDのN末端アミノ基に導入後、VEGF-Aとクロスリンクさせてコラーゲン結合型VEGFを産生し、in vitroで細胞増殖促進活性とコラーゲン結合能を示す予定である。
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| Causes of Carryover |
第92回日本細菌学会総会で研究成果を発表する予定であったが、通常の３月ではなく翌年度４月に開催されることとなったため、旅費相当額を次年度に繰り越した。また、13Cグルコースの使用が計画より少なく済んだことにより、相当額を次年度に繰り越した。旅費、消耗品費とも次年度に支出する予定である。
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[Journal Article] Acceleration of bone regeneration of horizontal bone defect in rats using collagen-binding basic fibroblast growth factor combined with collagen scaffolds.2019
Author(s)
Nakamura S, Ito T, Okamoto K, Mima T, Uchida K, Siddiqui YD, Ito M, Tai M, Okubo K, Yamashiro K, Omori K, Yamamoto T, Matsushita O, Takashiba S.
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Journal Title
J. Periodontol.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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