2018 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the regulatory mechanism of virulence expression by the retron containing reverse transcriptase gene in Vibrio cholerae
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18K07113
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
島本 整 広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (90187443)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
成谷 宏文 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (30452668)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | レトロン / 逆転写酵素 / msDNA / arcA / arcB / コレラ菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌逆転写酵素は，RNA-DNA複合体（msDNA）の合成を行っている。逆転写酵素遺伝子（ret）は，ゲノム上でmsDNAをコードする領域（msr-msd）とともにレトロンと呼ばれるオペロンを形成しており，一種の可動性遺伝因子だと考えられている。これまでにゲルシフト法によってコレラ菌由来のmsDNA-Vc95と特異的に結合するタンパク質が見つかっており，コレラ菌の病原性発現調節との関与が示唆されている。
今年度の研究では，レトロンの発現状況を簡便にモニタリングすることを目的として，コレラ菌が保有しないβ-グルクロニダーゼ遺伝子（gusA）をレポーター遺伝子としてレトロンのプロモーター下に挿入したレポーター系を構築した。今後，様々な培養条件下でのレトロン誘導条件を検討する。レトロンが大量発現または発現抑制されるような条件が見つかれば，msDNAの合成からデコイDNA（またはDNAアプタマー）としての機能を介したコレラ菌の新たな病原性発現ネットワークの一端を明らかにすることができる。
また，レトロンの逆転写酵素遺伝子（ret）以外の遺伝子産物との関与が示唆されているArcABについても解析を行った。ArcABは，二成分制御系の一種であり，コレラ菌の好気または嫌気条件に反応する遺伝子群の発現調節に関与していると考えられている。arcABそれぞれの遺伝子欠損株を作製し，カイコに対する病原性を野生株と比較したところ，病原性の低下が認められた。また，response regulatorであるArcAと標的遺伝子のプロモーター領域との結合をゲルシフト法で解析し，標的遺伝子との関係を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していたレトロンのレポーター系について，gusA遺伝子をレトロンプロモーター下に挿入し，SXT elementのインテグラーゼ遺伝子（int）に組み込むことができた。
また，ArcABの機能解析については，それぞれの遺伝子の欠損株を作製し，カイコに対する病原性の違いを野生株と比較することができた。
これらの研究結果は，おおむね当初の計画どおりに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，構築したコレラ菌のレトロンのレポーター株を用いて，様々な培養条件でレトロンの発現状況を調べる。特に，コレラ菌が感染する腸管内は極端な嫌気条件となっており，またArcABとの関係も示唆されていることから，嫌気条件下でのレトロンの発現状況には注目する必要がある。その他に，他のレトロンで発現誘導が起こる飢餓状態にも注目する。さらに，コレラ菌のレトロン内にコードされているORF540タンパク質とArcABとの関係を明らかにし，ORF540の機能解析を進めるとともに病原性発現との関係を明らかにする。
また，コレラ菌以外のビブリオ属細菌（特にコレラ菌類似のVibrio mimicus）の保有する新たなレトロンについても解析し，コレラ菌のレトロンと比較解析を行う。
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| Causes of Carryover |
研究計画が比較的順調に進んだため，当初の予定よりも消耗品の購入が少なかったことに加え，旅費の使用も当初の予定より少なかった。
コレラ菌のレポーター系の測定に必須のマイクロプレートリーダーが故障のため使用不可となってしまい，次年度の予算で急遽購入の必要が生じた。次年度の当初予算がほぼ機器の購入費用で使い切ってしまうため，残予算は次年度研究計画の消耗品購入費用として使用する予定である。
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