2019 Fiscal Year Research-status Report
Research on Physiological and Molecular mechanism of Eukaryotic Protein Kinase - Phosphatase System that Regulates Morphology of Clostridium perfringens
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18K07114
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
成谷 宏文 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 准教授 (30452668)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 教授 (40333512)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Clostridium perfringens / ガス壊疽菌 / シグナル伝達 / プロテインキナーゼ / プロテインホスファターゼ / 細胞壁生合成 / タンパク質相互作用 / Yeast Two-Hybrid Screen |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グラム陽性病原細菌に普遍的に存在する真核型 Protein Ser/Thr Kinase (K) - Phosphatase (P)シグナル伝達系の機能をClostridiumperfringens (ガス壊疽菌)をモデルとして解明する。我々は既に、K のリン酸化基質タンパク質として Clostridium属細菌に特異的な繰り返しタンパク質相互作用領域 (TPR) を有する膜タンパク質 (S) を同定し、そのThr-92のリン酸化調節で同菌の隔壁形成・分裂・形態（菌長）を制御することを見いだしている。また S が必須酵素: IspG（非メバロン酸経路: 細胞壁生合成に関与）と MurF (D-Ala-D-Ala Ligase:細胞壁生合成経路)との相互作用を見いだしている。
本研究では、タンパク質間の相互作用がいくつも統合された高次ネットワークで行われる菌の『形態形成』における S-IspG-MurF複合体形成 と K-P 制御のメカニズムを明らかにする事を目的とする。具体的には in vivo Cross-Link 法により S 複合体を K・P欠損株より単離し、その構成因子をLC-MS/MS により同定する。またK (二量体) の酸性アミノ酸(Glu/Asp)-Rich 領域の機能として His-Aspリン酸リレー系(Protein His Kinase) の走化性制御で知られる『メチル化Adaptation機構』を念頭に、Glu 変異株の解析、また Glu/Asp-Rich 領域との相互作用因子の同定を行う。本年度は、以下について検討を行った。
1） S の新規相互作用因子の探索
2） 他のClostridium属細菌S ホモログの比較解析/リン酸化部位決定
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1) S の新規相互作用因子の探索
Epitope-tag S をゲノム上で発現する変異株を作製し、Formaldehyde Cross-Linking (FACL)、Hisタグ-Pull-Down (PD)解析を行った。しかし、FACLではPsmによる溶菌/可溶化が困難であり、プロトプラストでのFACLでも同様であった。PDでは、HisタグSの発現及び非発現株の菌体をHisタグなしPsmで処理し(0.5 % CHAPS存在下)、菌体ライセートを調製、Ni-IMACにより分画した。SDS-PAGE後、発現株分画に特異的なバンドについてN末端アミノ酸配列の決定を試みたが量/純度等の問題で成功していない。そこで、EGSを用いた in vivo Cross-Link 法で S との複合体を検出すると、リン酸化/非リン酸化 S で 形成される高分子体の大きさ/量に相違が認められた。LC-MS/MS解析に供するため、より純度の高いサンプルの調整について洗浄等の条件検討を行い、サンプルの解析を行う予定である。
2） 他のClostridium属細菌S ホモログの比較解析/リン酸化部位決定
現在、Clostridium difficile，acetobutylicum，tetani等の菌体ライセートを調整し、Phosho-Thr抗体によるWestern-Blott解析を行っている。また、Phosho-Ser抗体での条件を検討し、１次元電気泳動では、複数のバンドが検出されるものもあり、現在、２次元電気泳動を検討している。いくつかLC-MS/MS解析を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、
1） S の新規相互作用因子の探索：LC-MS/MS解析を行い、特定された因子の欠損株作製等の遺伝子解析を行う。
2） 他のClostridium属細菌S ホモログの比較解析/リン酸化部位決定：リン酸化タンパク質の分画をAffinity-Chromatographyで行い、Phosho-Thr/Ser抗体によるWestern-Blott解析で確認後、LC-MS/MS解析によりリン酸化部位を含めタンパク質の特定を行う。
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| Causes of Carryover |
LC-MS/MS解析の未発注、消耗品等の購入費が少なく済んだため。LC-MS/MS解析の外注費用等に当てる。
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