2019 Fiscal Year Research-status Report

鉄制限と炭素源制限に対するストレス応答の連携による腸炎ビブリオの病原因子発現制御

Research Project

Project/Area Number	18K07130
Research Institution	Matsuyama University
Principal Investigator	田邊知孝松山大学, 薬学部, 准教授 (60532786)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	腸炎ビブリオ / 鉄獲得系 / 炭素源 / シデロフォア / 3型分泌装置
Outline of Annual Research Achievements	病原細菌の病原性発現は菌の増殖環境によって大きく変化する。また、病原細菌は宿主内において複数の環境ストレスを受けている。そのため、病原細菌の病原性発現を理解するためには、複数のストレスに対する相互連携的な応答による病原因子発現制御機構を解明する必要がある。本研究では、病原細菌の感染部位の一つである回盲部や大腸内では二価鉄や単糖がほとんど無いということに着目し、食中毒原因菌である腸炎ビブリオにおける鉄制限及び炭素源制限のストレスに対する連携的な応答による病原因子の発現制御について解析を進めている。 2019年度は、炭素源制限下やアミノ酸制限下における警告物質であるグアノシン4リン酸（ppGpp）と、腸炎ビブリオの病原因子の一つと考えられるvibrioferrin［シデロフォア（微生物が産生する三価鉄キレート分子）の一種］の産生との関連について検討した。まず、腸炎ビブリオのppGpp非産生株を作製しvibrioferrin産生量を調べたところ、ppGpp非産生株では野生株に比してvibrioferrinの産生量が著しく低下していた。また、ppGpp非産生株では、vibrioferrin生合成遺伝子の発現が野生株に比して低下していた。これらのことから、vibrioferrinの産生は、鉄制限だけでなく、炭素源制限下やアミノ酸制限下で産生されるppGppによって影響を受けることが示唆された。また、ppGppと共同でRNAポリメラーゼに作用し転写制御していることが知られているDksAが腸炎ビブリオの病原性発現において影響を及ぼすかを検討した。Caco-2細胞を用いたLDHアッセイで評価した結果、DksAは、３型分泌装置2（T3SS2）を介する病原性には影響をしないものの、３型分泌装置1（T3SS1）を介する病原性に関与することが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 腸炎ビブリオの病原因子である2種の3型分泌装置（T3SS1、T3SS2）の発現とDksAとの関連について、また、腸炎ビブリオの病原因子と考えられる鉄獲得系の発現とppGppとの関連についての検討がやや遅れている。また、2018年度に炭素源制限応答に関わる転写因子であるCRPがT3SS2を介する病原性発現を調節していることを見出したが、このメカニズムに関する知見が十分に得られていない。これらのことについては、2020年度の早い時期に検討する予定である。
Strategy for Future Research Activity	・これまでにDksAがT3SS1を介する細胞毒性の増強に関与していることが分かっている。本年度は、どのT3SS1の構成要素をコードする遺伝子がDksAによって影響を受けるかをRT-qPCRで明らかにする。また、dksA欠失株において、T3SS1を介する細胞毒性の発揮に重要なエフェクタータンパク質であるVP1680の菌体外への分泌量が、野生株と比較して低下しているのかをウエスタンブロットで検討する。さらに、dksA欠失株と野生株との間において、VP1680のシャペロンであるVP1682の発現量に違いがあるのかについても検討する。・2018年度の研究結果より炭素源制限応答に関わる転写因子であるCRPがT3SS2遺伝子の発現を調節していることが示唆された。これは、T3SS2遺伝子群の発現が、CRPに発現調節される小分子RNA Spot 42によって調節されている可能性が考えられ、実際にSpot 42の標的となりうるT3SS2の構成要素をコードするmRNAも見出された。2020年度は、Spot 42の標的となりうるT3SS2 mRNAとSpot 42の結合実験やin vitro翻訳解析等を実行する。・これまでに、ppGppがvibrioferrin産生増加に関与することがわかっている。また、ppGppが鉄-vibrioferrinの取り込みに関わる外膜受容体の発現や、さらには、外因性シデロフォアの取り込みに関わる外膜受容体の発現にも影響するという知見も得られている。そこで、ppGpp非産生株と野生株において、鉄制限下におけるシデロフォアの取り込みに関わる外膜受容体の発現量の違いをRT-qPCRやウエスタンブロットで明らかにする。