2019 Fiscal Year Research-status Report
ウエルシュ菌溶菌酵素の種特異性機構の解明と応用研究
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18K07131
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| Research Institution | Matsuyama University |
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Principal Investigator |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 教授 (40333512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神鳥 成弘 香川大学, 医学部, 教授 (00262246)
成谷 宏文 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 准教授 (30452668)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 溶菌酵素 / ウエルシュ菌 / デフィシル菌 / ペプチドグリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
溶菌酵素は、細菌の細胞壁を分解し溶菌させることによって細菌を死滅させることができる酵素であり、一般的に結合ドメインと触媒ドメインからなっている。また、その作用には種特異性を持つものもある。Psmは、ウエルシュ菌特異的溶菌酵素であり、その種特異性は明らかとなっていない。本研究では、Psmを中心として様々なグラム陽性嫌気性桿菌の溶菌酵素の構造を明らかにし、その種特異性のメカニズムを明らかにすることを目的とする。
本年度は、Psmと比較解析を行うため、ウエルシュ菌の同族菌であり細胞壁の構造が少し異なるデフィシル菌の溶菌酵素に注目しそれらの種特異性を含む生化学的解析および構造解析を行った。デフィシル菌630株のゲノムより溶菌酵素と思われる遺伝子（CD24020）をクローニングし、大腸菌で大量発現を行い、Niアフニティークロマトグラフィーおよび各種クロマトグラフィーにより高度に精製を行った。さらに、種特異性を調べたところデフィシル菌特異的に溶菌活性を示した。しかし、バインディングに関しては種特異性を示さなかったことおよび触媒ドメインのみだけでも結合および溶菌活性を示した。さらに、CD24020の触媒ドメインの結晶スクリーニングにおいて良好な結晶を得ることができ、その構造を明らかにすることができた。また、活性中心やその近傍のアミノ酸の変異体を作成しその活性を測定し、基質結合ポケットおよび反応メカニズムを明らかにした。一方、デフィシル菌630株には、複数の溶菌酵素と思われる遺伝子（CD09610、CD11350、CD13680、CD27680）が存在しており、それらもクローニングし、発現、精製が完了しており現在その種特異性をはじめとする生化学的解析および結晶化スクリーニングに着手している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウエルシュ菌の同族菌であるデフィシル菌の溶菌酵素（CD24020）をクローニングし発現・精製および種特異性をはじめとする生化学的解析を行い、デフィシル菌特異的に作用することをおよびその生化学的性質を明らかにした。また、CD24020の触媒ドメインの結晶化に成功し、X線結晶構造解析によりその構造を明らかにした。さらに、活性中心の変異体を用いた解析により基質結合ポケットおよびその反応メカニズムを明らかにした。また、デフィシル菌の他の溶菌酵素に関しても研究に着手しており、これらの結果より本研究がおおむね順調に進展していると考えられる。一方、本年度予定していたPsmやCPE1138の結合基質の解析に関しては、CD24020の解析が順調に進んだことから後回しになっていることは今後の課題となる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでにデフィシル菌630株の溶菌酵素をクローニングし、発現・精製を行っている。これらの溶菌酵素の種特異性を含む生化学的性状の解析を進めるとともに、その構造を明らかにしペプチドグリカン分解メカニズムおよび種特異性を明らかにする。さらに、Psmとの比較解析を行うことにより溶菌酵素の種特異性の分子基盤を明らかにする。なお、Psmに関しては、その結合基質を引き続き明らかにする。具体的には、ペプチドグリカン成分をHPLCで分画し、GST融合Psm結合ドメインと抗GST抗体を用いて結合基質の分離を行い、Tof-Mass解析により同定を行う。さらに、同定された結合基質とPsmの供結晶の作成を試みる。
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